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猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2，PCV2）属于圆环病毒科，圆环病毒属，是目前已知最小的动物病毒之一，无囊膜，基因组为单股环状DNA，全长为1768nt或1767nt，由11个开放阅读框组成。研究证明ORF1编码复制相关蛋白(Rep)，ORF2编码核衣壳蛋白（Cap），ORF3编码的蛋白能够诱导细胞凋亡。PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning Multisystemic WastingSyndrome，PMWS)的主要病原，引起发病猪消瘦、呼吸困难、腹泻、可视粘膜苍白、也会伴发皮炎，剖检可见淋巴结肿胀，肾脏损伤等症状。淋巴细胞减少是PCV2感染后引起的特征性表现。
本研究旨在:(1)制备PCV2 Cap蛋白的单克隆抗体;(2)初步探明GRP78蛋白与PCV2复制相关;(3)初步探明PCV2感染PK-15细胞后激活未折叠蛋白反应的通路。
1.PCV2 Cap单克隆抗体的制备
将PCV2 Cap蛋白基因的重组质粒pET-30a(+)-ORF2经鉴定后转化入BL21感受态细胞并用IPTG进行诱导表达。经SDS-PAGE分析，重组蛋白大小约为30KD。将纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠，取脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行融合，以表达的融合蛋白作为包被抗原，通过间接ELASA方法对融合细胞上清进行抗体测，并通过有限稀释法，获得了3株能稳定分泌抗Cap蛋白抗体的杂交瘤细胞株，将其命名为B3、B9和D11。经Western blot检测，所获得的3株单克隆抗体均能与PCV2的SY4株和病料分离株产生特异性反应。
2.PCV2感染诱导未折叠蛋白反应PERK通路
通过免疫印迹(Western Blot)检测PCV2感染后不同时间内质网应激反应标志分子GRP78的表达情况，发现PCV2感染能显著上调伴侣分子GRP78表达，并呈时间依赖性。说明PCV2感染后能诱导内质网应激反应。
PCV2感染激活PERK途径。通过Western blot检测PERK的直接作用底物eIF2α的磷酸化，发现在PCV2感染后24h就能检测到磷酸化的eIF2α，36h达到最高水平，48h有所下降。说明PCV2感染早期就能通过磷酸化的e1F2a抑制蛋白的翻译，激活PERK途径。对eIF2α下游分子检测发现，当PCV2持续感染，细胞不能通过UPR恢复自身稳态时，磷酸化的eIF2α通过激活转录因子ATF4诱导下游基因CHOP和GADD34的表达上调，由CHOP基因介导内质网相关的细胞凋亡，同时由GADD34基因对UPR进行负反馈调节。
PCV2感染不激活IRE1/XBP1途径。RT-PCR和酶切检测发现PCV2感染PK-15细胞后，IRE1的唯一作用底物XBP1的mRNA并未发生剪切，以XBP1u剪切形式存在。利用RT-PCR检测发现，XBP1s的靶基因，如介导内质网相关性降解的蛋白EDEM和UPR负反馈调节蛋白p58IPK以及仅依赖于XBP1s识别的UPR元件在PCV2感染后的PK-15细胞中均未发生上调。说明PCV2感染不激活IRE1/XBP1途径。
3.沉默GRP78抑制PCV2复制
si-grp78的PK-15细胞中，PCV2基因组DNA拷贝数减少，但与对照组相比差异不明显，病毒的TCID50亦有所下降。
综上所述，本研究初步探明了PCV2感染后对宿主细胞UPR的影响，为深入研究PCV2感染与宿主细胞之间的相互作用及其对致病性的影响奠定了良好基础。