肺炎支原体感染不同MBL基因型绵羊引起免疫因子变化规律的研究

来源 :石河子大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:loyovue0603
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天然免疫系统中甘露糖结合凝集素(Mannan-bindinglectin,MBL)是模式识别受体中的重要分子,是一种由肝脏合成,存在于血清中的C型凝集素,通过识别并结合多种病原微生物、变异细胞表面的糖类物质而发挥免疫调理作用,或通过MBL途径激活补体而发挥调理吞噬作用。现被认为可能是宿主非特异免疫中最重要的第一线抗感染免疫分子。MBL结构基因发生突变,产生MBL基因的多态性,影响了MBL血清浓度水平,从而降低机体的免疫防御能力,造成免疫损伤。本实验以新疆地区发生较严重的绵羊支原体肺炎为疾病模型,人工感染绵羊肺炎支原体的同时,利用ELISA和荧光定量PCR技术,从蛋白水平和基因表达水平上测定各种细胞因子与补体的表达变化,并利用病理学评分方法,对不同MBL基因型个体在其感染过程中进行了免疫应答分析,验证不同MBL基因型与支原体肺炎的抗性关系,具体结果如下:  (1)建立不同MBL基因型绵羊支原体肺炎动物疾病模型。利用已冻存的绵羊肺炎支原体分离株,与标准菌株Y98同源性为98%,将其增殖培养,菌液测定达到人工感染浓度,气管注射,攻毒后每日观察其临床症状,三周后用无菌咽拭子随机采集人工感染组与对照组鼻腔分泌物,进行绵羊肺炎支原体回收培养,同时进行多项支原体生化鉴定,并制作病理组织切片观察病理变化,成功建立了绵羊支原体肺炎感染模型。  (2)ELISA检测中国美利奴羊不同MBL基因型个体感染绵羊肺炎支原体的免疫应答变化:对四种不同MBL基因型个体进行MBL水平测定,选择其中6只作为对照组,32只为实验组,在相同饲养条件下人工感染绵羊肺炎支原体,分别在攻毒前一天(0d)、攻毒后一天(1d)、一周(7d)、两周(14d)、三周(21d),用ELISA方法定量分析血清中TNF-α、IFN-γ、补体C1、C3水平。结果显示A型和B型其MBL浓度较低,C型MBL浓度较高,与对照组相比,在攻毒后一周,A型和B型IFN-γ表达显著降低(P<0.05),在攻毒后两周,补体C3表达显著降低,TNF-α升高显著(P<0.05);与A型和B型相比,在攻毒后一周,C型IFN-γ表达增加(P<0.05),在攻毒后两周,补体C3表达增加、TNF-α显著降低(P<0.05),补体C1各组均不显著。结论:低血清MBL浓度与绵羊支原体肺炎有一定的相关性,不同基因型之间其TNF-α、IFN-γ、补体C1、C3水平有差异,低浓度MBL绵羊更易发生比较严重的炎症反应。  (3)对不同MBL基因型绵羊支原体肺炎动物疾病模型进行组织病理学评分,对其肺炎程度进行量化评价:本研究选择MBL外显子1上四种不同基因型(A、B、C和D型)共32只绵羊作为实验组,选择6只健康羊作为对照组,在人工感染绵羊肺炎支原体三周后全部宰杀,收集肺脏组织做病理切片,以组织病理学评分来确定肺部的炎症反应程度。不同MBL型绵羊的肺脏呈现不同程度的病理改变,组织病理学评分的结果为MBLA和B型平均分分别为18.3和19.1,表现为重度病变;MBLC型平均分为8.9,表现为轻度病变;MBLD型平均分为12.3,表现为中度病变;本研究以组织病理学评分方法客观地量化了不同MBL基因型肺部炎症反应的严重程度,根据评分结果可以推测MBLA型和MBLB型为易感型,而C型为抗性型。  (4)荧光定量PCR检测不同MBL基因型感染绵羊肺炎支原体前后多种免疫因子mRNA基因表达变化:对四种不同MBL基因型个体进行实时荧光定量PCR检测其MBL、IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α、C1和C3等相关免疫因子,结果显示,不同MBL基因型绵羊攻毒感染后血清MBL浓度呈下降趋势,随攻毒时间的延长,导致免疫水平发生不同的变化,其中MBL浓度较高的C型和D型其促炎因子IL-2、IFN-γ浓度较高,抗炎因子IL-4在攻毒后1d呈升高趋势,此后开始下降;MBL浓度较低的A型和B型攻毒后其TNF-α浓度升高显著,随炎症的舒缓,逐渐降低;补体C1和C3在攻毒后表现出不同的变化,证实MP感染后,激活补体途径,可能与MBL的浓度变化有关。
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