研究背景和目的：前列腺癌(Prostate Cancer, PCa)和前列腺增生症(Benign Prostatic Hyperplasia, BPH)是泌尿外科的常见疾病。约13.6%的泌尿外科住院患者被诊断为前列腺增生症,前列腺癌的发病率具有明显的地理及种族差异。在欧美等发达国家和地区,它是男性最常见的恶性肿瘤,约占男性恶性肿瘤的1/3,其死亡率居各种癌症的第二位,仅次于肺癌。以美国为例,近十年来,前列腺癌的发病率每年稳定在二十万例左右,死亡率接近20%。在亚洲,其发病率远低于西方国家,但近年来呈迅速上升趋势。我国被认为是前列腺癌的低发区,但是随着人群寿命的延长,饮食结构及生活习惯的改变,以及疾病检测手段的提高,前列腺癌的发病率逐年上升。顾方六等通过对北京大学泌尿外科研究所50年来泌尿外科各种肿瘤构成比发生的变化进行统计分析,发现前列腺癌患者数量呈直线上升的趋势。由此可以预测前列腺癌将会成为严重威胁我国男性健康的疾病之一。所以在现阶段,进一步深入研究前列腺癌的发生、发展过程及规律,对前列腺癌的预防及诊治具有重大的临床意义。目前临床上主要通过前列腺特异抗原(prostate specific antigen, PSA)筛查以及初步诊断前列腺癌,使用Gleason评分对前列腺癌进行病理分级,应用TNM分期对前列腺癌进行临床分期。前列腺特异性抗原是由前列腺上皮细胞分泌的一种糖蛋白酶。前列腺癌患者的PSA会升高,然而PSA并非前列腺癌细胞所特有,在某些疾病如前列腺增生、前列腺炎、甚至乳腺癌也会引起血清中的PSA升高。当PSA为4～10ng/ml时,是前列腺癌的诊断灰区,难以区分前列腺癌及前列腺增生症。而进行Gleason评分时,也会因取材的部位以及病理医生主观判断的影响,而难以对前列腺癌的恶性程度进行客观、准确的判定。因此迫切需要寻找一种新的、特异性高的、敏感性强的,能早期诊断前列腺癌,且可反映其侵袭力及判断患者预后的标记物。转录组学分析是通过寡聚核苷酸芯片、cDNA芯片等方法检测转录活性,在RNA水平上研究基因表达的情况,可以了解某种组织或某个细胞在某一时刻的转录情况,具有时间性及空间性。基因的表达情况在疾病的潜伏期、进展期及临床治疗期间是持续变化的。了解不同疾病时期的基因表达情况有助于明确疾病的发病机制及制定治疗方针。人类基因组计划已经鉴定出大约32,000个基因,这些基因的表达水平目前可通过微阵列技术进行检测。这些技术的发展从根本上为研究人员提供解决生物医学问题的新方法,并为发现某些与疾病相关的重要分子如肿瘤标记物等创造了新的条件。目前通过杂交技术来获得转录组数据和分析的方法主要有两种,其中最出名的莫过于Affymetrix公司于1991年开发出的寡聚核苷酸芯片,第二种主要的技术平台是编排在玻片上或其他类型的固体载体上的cDNA片段或长寡聚核苷酸。蛋白质组学的研究主要是通过分析蛋白质在二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)中的不同表达情况,了解蛋白质的表达水平。近年来,通过二维色谱法进行质谱分析可进一步对蛋白质进行定性分析。蛋白质组学被认为是总体上评估蛋白质表达情况的一种有效的研究方法,可广泛应用于疾病的研究,为众多种疾病特别是恶性肿瘤发生、发展机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。双向差异凝胶电泳技术(2D-DIGE)被公认为是一种可准确定量测定蛋白质的有效方法,它可减少内部凝胶差异及简化凝胶电泳分析。双向差异凝胶电泳技术是将样品在双向电泳之前分别以不同荧光染料(如Cy2,Cy3,Cy5)标记,然后将标记后的3种样品混合,同时在一块胶上进行电泳,所得到的2D凝胶图像可使用3种不同的激发／发射过滤器得到不同颜色荧光信号,根据这些信号的比例来判断样品之间蛋白质的差异。在双向差异凝胶电泳技术中,每个蛋白点都有它自己的内标,并且软件会根据每个蛋白点的内标对其表达量进行全自动的校准,避免了不同凝胶之间的差异对分析结果带来的影响,保证了实验条件的一致性,有利于差异表达点的筛选。有文献报道双向差异凝胶电泳蛋白定量与代谢稳定同位素标记之间具有良好的相关性。此外,此方法仅需进行一次实验,可减少凝胶剂的使用数量。因此,双向差异凝胶电泳技术已被应用于部分肿瘤的蛋白研究,包括肝细胞癌、结肠直肠癌、食道鳞状上皮癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌及有淋巴结转移的前列腺癌等。目前已有研究报道通过微阵列技术可有效区分肿瘤的亚型,通过检测亚型基因的表达可明确诊断并指导临床治疗。肿瘤蛋白的表达不仅有助于肿瘤的筛查及诊断,也可反映肿瘤的进展情况,同时可以作为药物靶向治疗的目标蛋白。然而,目前关于前列腺癌相关蛋白质的研究仍然较少。因此,本研究希望通过联合应用基因微阵列技术检测mRNA表达情况,2D-DIGE对差异蛋白进行定量分析,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析(MALDI-TOF-MS)对差异蛋白进行定性分析,找出与mRNA表达情况相符的蛋白并通过ELISA方法对临床血液样本进行验证。结合候选蛋白的表达情况与临床病理资料进行分析,找出有助于诊断前列腺癌及判断患者预后的新肿瘤标记物。材料：本研究经广州市第一人民医院伦理委员会批准,患者签署知情同意书及样本取材同意书。收集广州市第一人民医院泌尿外科2010年9月至2011年2月收治的4例前列腺癌病人的临床开放手术,TURP(经尿道前列腺切除术)切下的组织。取得样本后,马上放入液氮瓶中速冻,以-80℃低温保存至使用。患者平均年龄70.5岁(54-80岁)。与此同时收集另外84例前列腺癌、35例前列腺增生症患者术前血液样本及21例志愿者血液样本,用作ELISA试验检测目标蛋白血液浓度。前列腺癌患者平均年龄74.3岁(49-87岁)；血清PSA<10ng/mL者10例(11.9%),≥10ng/mL者74例(88.1%)；Gleason评分<7分者34例(40.5%),≥7分者50例(59.5%)；有远处转移者9例(10.7%)。35例前列腺增生患者平均年龄71.1岁(56-89岁),血清PSA<10ng/mL者23例(65.7%),≥10ng/mL者12例(34.3%)；21例志愿者平均年龄30.42岁(18-43岁)。方法：联合应用转录组学及蛋白质组学检测4对前列腺癌及其癌旁组织,找出共同表达差异的mRNA和蛋白质,结合GEO数据库检索,筛选出候选肿瘤标记物并通过ELISA方法检测血浆蛋白表达情况进行验证,最后分析蛋白的表达情况与临床病理数据之间的关系：(1)、获取4组前列腺癌及其癌旁临床样本组织,通过HE染色并进行显微切割获取较纯净的组织样本。(2)、提取并纯化样本组织的总RNA用作基因芯片杂交。(3)、通过Agilent基因芯片(Agilent-014850Whole Human Genome Microarray4x44K G4112F)作RNA检测。(4)、使用生物传感连接器分析芯片数据,筛选出差异表达基因。(5)、提取并纯化组织样本蛋白质。(6)、经蛋白电泳银染预实验后,使用Cy2、Cy3及Cy5对提取蛋白进行荧光染料标记。(7)、对标记的蛋白进行2D-DIGE实验。(8)、通过荧光扫描仪(Typhoon9400; GE Healthcare)对凝胶进行扫描、成图。(9)、通过软件DeCyder5.01(GE Healthcare)进行图像分析,找出差异蛋白点。(10)、通过MALDI-TOF质谱法在4800蛋白组学分析器(Applied Biosystems)上鉴定差异蛋白。(11)、检索GEO数据库中RNA芯片的表达情况,筛选出6个蛋白作为候选肿瘤标记物。(12)通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测84例前列腺癌、35例前列腺增生症患者及21例志愿者血液样本中候选肿瘤标记物浓度。(13)、分析候选肿瘤标记物血浆浓度在不同实验组的表达情况及其与临床病理数据的关系。统计学处理：采用SPSS13.0软件包进行数据处理。由软件对前列腺癌及癌旁组织差异表达基因进行配对t检验(P<0.05)。由软件对前列腺癌及癌旁组织差异表达的蛋白进行配对t检验(P<0.05)。候选肿瘤标记物的血浆水平以x±s表示,候选肿瘤标记物血浆浓度在不同实验组表达情况采用单因素方差分析(one-way ANOVA),两两比较采用Bonferroni法,若方差不齐则采用Welsh法对多个均数进行比较并采用Tamhane’s T2法进行两两比较；候选肿瘤标记物血浆浓度与临床病理数据的关系进行两独立样本t检验,方差不齐则采用t’检验。双侧P<0.05则认为差异有统计学意义。结果：1.对4组前列腺癌及其癌旁组织的RNA进行基因芯片杂交,所得数据进行配对t检验(P<0.05),共发现1207个差异表达基因,其中上调的差异表达基因652个,下调差异表达基因555个。2.2D-DIGE后,对每块凝胶的Cy2,Cy3,和Cy5独立荧光成像,所得图像通过DeCyder5.0软件进行分析,发现在2566个配对的蛋白点中,肿瘤组中有89个点上调(肿瘤/非肿瘤比率>2,P<0.01),66个点下调(肿瘤/非肿瘤比率<-2,P<0.01)。3.联合应用2D-DIGE及质谱法进行分析,共确认出前列腺癌组织中60个差异表达的蛋白,其中37个上调,23个下调。根据Swiss-Prot数据库分析,16个蛋白定位在细胞浆,15个蛋白定位在线粒体,12个蛋白定位在细胞核,4个定位在细胞外。其中13个蛋白的亚细胞定位未能明确。此外,60个差异蛋白中,25(47.1%)个与细胞代谢过程有关,18(30.0%)与生物学调节有关,8(13.3%)个与基因表达有关,6(10.0%)个与细胞运动有关,3(8.0%)个与细胞的局部粘附(定位)有关。再者,根据蛋白的功能级别进行分组可分为：1、酶类(30,50.0%,包括氧化还原酶类,水解酶类,转移酶类,异构酶,和裂合酶类)；2、结合蛋白质(28,47.5%)；3、信号传导蛋白(6,10.0%)；4、转移相关蛋白(4,6.7%)；5、载体蛋白类(2,3.3%)；6、转录因子(2,3.3%)；7、未知功能蛋白(10,16.7%)。4.结合基因芯片及2D-DIGE结果,找出共同表达差异的分子(蛋白质)14个。分别为：ACLY, CAPG, GSTM3, GSTP1, HNRNPL, IMPDH2, KRT15, MCCC2, MSN, MYL9, PYGB, SERPINB5, TRAP1和VCL。5.通过GEO数据库检索,在14个差异蛋白中筛选出IMPDH2、MCCC2、 TRAP1、CAPG、KRT15以及MYL9等6个候选蛋白作血液样本浓度检测。6.运用ELISA方法检测84例前列腺癌、35例前列腺增生症及21例志愿者血液样本中上述6个蛋白质的血浆水平,所得数据进行两独立样本t检验(P<0.05),发现与前列腺增生及正常对照比较,MCCC2、TRAP1及IMPDH2在前列腺癌患者血液中的水平明显升高(P<0.05),与2D-DIGE的实验结果相符。7.对上述6个蛋白质的血浆浓度与临床病理资料进行两独立样本t检验(P<0.05),发现血浆IMPDH2水平与患者年龄(P=0.551)、前列腺体积(P=0.315)及血清PSA水平(P=0.507)无明显相关性,但与Gleason评分及转移相关。Gleason评分≥7分前列腺癌患者的IMPDH2水平明显高于Gleason评分<7分患者(P=0.030)。有转移的前列腺癌患者的IMPDH2水平明显高于非转移者(P=0.023)。Gleason评分≥7分前列腺癌患者的MCCC2水平明显高于Gleason评分<7分患者(P=0.018)。有转移的前列腺癌患者的MCCC2水平明显高于非转移者(P<0.001)。前列腺体积>68ml患者的血浆TRAP1水平较高(P=0.032)。CAPG、KRT15以及MYL9的血浆水平与患者年龄、前列腺体积、血清PSA水平、Gleason评分及是否转移均无明显相关性。结论：1.通过联合应用基因芯片、2D-DIGE及质谱分析对前列腺癌组织标本进行检测,是发现肿瘤标记物的一种有效方法。2. IMPDH2及MCCC2的表达与前列腺癌的Gleason评分及转移呈正相关。3. TRAP1的表达与前列腺体积呈正相关。4. IMPDH2及MCCC2的检测有助于提高前列腺癌的早期诊断率,有望成为反映肿瘤恶性程度及预后判断的新血浆标记物。