妊娠期高血压疾病(hypertension disorder complicating pregnancy, HDP)是妊娠期严重危害母婴安全的重要疾病,发病机制尚不明确,研究者们普遍认为妊娠期高血压疾病的发生是多因素多途径共同致病的,其中心环节是母体全身弥漫性内皮细胞的激活和(或)损伤,由此带来了各种临床症状如高血压、蛋白尿、全身炎症反应以及抗血管生成因子的聚集。内皮细胞激活和损伤的机制不明,但有学者指出妊娠期高血压疾病内皮的损伤在早孕期即存在,内皮激活导致滋养细胞对子宫螺旋动脉的浸润障碍,胎盘浅着床,胎盘缺血、缺氧以致其合成和释放过多的“毒性因子”进入循环,直接或间接损伤母体内皮细胞的功能。目前已知的与疾病发生相关的“毒性因子”包括肿瘤坏死因子、可溶性fm样酪氨酸激酶1(sFlt-1)和endoglin (sEng)、合体滋养层细胞微粒(STBM)等,有学者对这些因子与妊娠期高血压疾病发病的预测能力进行研究,遗憾的是这些因子并不能很好的预测疾病的发生和发展。因此我们希望能够通过某种途径了解内皮损害的情况,判定疾病发生和发展的程度,尽早的给予合理的预防和治疗,这对于临床诊断和治疗妊娠期高血压疾病是具有重要意义的。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)是一种新发现的脂蛋白(lipocalin),可促进多种细胞生长和分化,促进组织内蛋白水解和胶原降解,当炎症或肿瘤发生时组织内的NGAL迅速升高,有学者指出NGAL是评价因炎症或肿瘤形成而导致内皮损伤严重程度的重要标志物。同时大量研究证实NGAL是早期检测肾功能衰竭和急性炎症的重要指标,具有高度的敏感性和特异度；另外研究发现高血压患者血液中NGAL的含量较正常人群也出现显著升高。鉴于子痫前期同时具有内皮损伤、高血压和肾脏功能损伤的特点,2008年意大利学者D′ANNA提出NGAL可能与子痫前期的发病有关,并通过检测48例子痫前期患者24周-26周时血液中NGAL的含量,认为中孕期血液NGAL的升高是预测子痫前期发生的敏感指标。这个研究结果初步揭示了NGAL与子痫前期的关系,但子痫前期患者在妊娠晚期出现临床症状后NGAL的表达如何；妊娠期高血压患者较子痫前期患者病情轻,其体内NGAL是否也存在异常改变；除了血液中NGAL表达异常,在尿液和胎盘组织中是否也存在NGAL的异常表达目前尚无研究。本课题通过对不同阶段妊娠期高血压疾病患者血液、尿液以及胎盘组织中NGAL的测定,了解妊娠晚期患者不同组织中NGAL的表达,并结合其临床特征,探求NGAL与疾病严重程度的相关性,希望找到一个有效的指标,能够简单、快速的判定疾病发展的程度,在疾病发生的早期即给予干预和治疗,延缓疾病的发生和发展,监测疾病的治疗效果,降低高危妊娠的发生率,改善母儿预后。第一章妊娠期高血压疾病患者血、尿及胎盘组织中NGAL的表达[目的]妊娠期高血压疾病患者均存在不同程度的全身炎症反应和内皮损害,我们通过检测其外周血、尿液及胎盘组织中NGAL的表达,初步探求NGAL在妊娠期高血压疾病的发病过程中的作用和意义。[方法]1、实验分组：选择2009年3月至2009年12月在南方医院及深圳市妇幼保健院因妊娠期高血压疾病住院的孕妇共86例,排除慢性高血压史、妊娠期糖尿病或糖尿病合并妊娠、感染、慢性肾炎、红斑狼疮史、自发性胎膜早破、胎儿生长受限、胎儿畸形及辅助生殖等因素后,共获得妊娠期高血压疾病患者38例,其中妊娠期高血压组9例、晚发型子痫前期17例(包括轻度子痫前期组7例、重度子痫前期组10例),早发型子痫前期12例,所有诊断均在分娩12周后最终确诊。选择同期足月妊娠并分娩健康新生儿的孕妇为正常对照组共30例。2、标本采集：两组均于入院24小时内抽肘静脉血3ml,于入院第2日取晨尿3ml,于分娩时胎盘娩出后,取近脐根部母体面胎盘组织2.0cm x 1.0cm x 0.2cm,平均分成两个部分,一部分与经过处理后的血液和尿液标本置入-80℃冰箱保存备用,另一部分置入4%甲醛4℃保存备用。3、NGAL的检测：采用ELISA法检测两组孕妇血液和尿液中NGAL的表达,免疫组化法和Westen Blot法检测胎盘组织中NGAL的表达。4、应用SPSS13.0软件进行统计学分析,两独立样本t检验进行组间比较,p<0.05有统计学差异。[结果]1、妊娠期高血压疾病组和正常对照组血液及尿液中NGAL的表达与比较妊娠期高血压疾病组(n=38)血液中NGAL含量为567.3348±195.9752mg/L,尿液中NGAL含量为113.9165±40.4284mg/L;正常对照组血液中NGAL含量为136.1140±28.5699mg/L,尿液中NGAL含量为75.1449±10.1471mg／L。两组血液中NGAL比较有显著性差异(F=50.748,P=0.000),尿液中NGAL比较亦有显著性差异(F=49.682,P=0.000)；水平分析妊娠期高血压疾病组血液及尿液中NGAL的含量呈正相关(r=0.8,p=0.000)。2、妊娠期高血压疾病组和正常对照组胎盘组织中NGAL的表达与比较免疫组化结果示：妊娠期高血压疾病组胎盘组织中均有NGAL的阳性表达,其中妊娠期高血压组表达强度为(+),轻度子痫前期组表达强度为(+～++)。重度子痫前期组表达强度为(+++),早发型子痫前期组表达强度为(+++～++++)；正常对照组NGAL表达不明显。Westen blot结果示妊娠期高血压疾病组有明显的电泳条带。[结论]妊娠期高血压疾病患者血液、尿液及胎盘组织中均有NGAL的表达,与正常对照组比较妊娠期高血压疾病组血液及尿液中NGAL水平显著升高,同一患者血液中NGAL含量与尿液中NGAL含量具有正相关性。妊娠期高血压疾病患者妊娠晚期体内NGAL的异常表达为我们进一步研究NGAL与疾病严重程度的相关性奠定了基础。第二章妊娠期高血压疾病患者NGAL水平与疾病严重程度的相关性分析[目的]妊娠期高血压疾病患者NGAL的显著升高与全身炎症反应和内皮损害有关,我们分别检测不同严重程度妊娠期高血压疾病患者血液及尿液中NGAL含量以探求NGAL是否与妊娠期高血压疾病病情的严重程度相关。[方法]1、ELISA法检测不同严重程度妊娠期高血压疾病患者血液及尿液中NGAL的含量；2、病例组临床特征的采集：(1)基本情况,年龄、发病孕周、病程等；(2)临床症状,入院时血压、体征及自觉症状；(3)辅助检查,血尿常规、肝肾功能、24小时尿蛋白。3、应用SPSS13.0软件进行统计学分析,应用单因素方差分析Welch法检测方差齐性,因方差不齐应用Games-Howell进行组间多重比较；用Pearson相关分析法对妊娠期高血压疾病患者的临床特征及NGAL含量进行相关性分析；用Spearman rho分析法对妊娠期高血压疾病患者疾病严重程度与NGAL含量进行相关性分析。p<0.05为有显著性差异。[结果]1、不同严重程度妊娠期高血压疾病患者血液及尿液中NGAL的表达妊娠期高血压组血液中NGAL含量为377.0352±50.2905mg／L,尿液中NGAL含量为89.3235±10.6441 mg/L;轻度子痫前期组血液中NGAL含量为373.1072±51.2086mg／L,尿液中NGAL含量为88.7220±6.0632 mg／L；重度子痫前期组血液中NGAL含量为600.0151±30.5950mg／L,尿液中NGAL含量为105.2433±32.7259mg/L;组间结果比较显示：妊娠期高血压组血液中NGAL含量与重度子痫前期组比较有统计学差异(p=0.000),轻度子痫前期组血液中NGAL含量与重度子痫前期组比较有统计学差异(P=0.000),余血液NGAL均无统计学差异；尿液中NGAL含量组间比较均无显著性差异(P>0.05)。2、NGAL与疾病临床表现的相关性妊娠期高血压疾病组患者血液中NGAL含量与患者血压及尿蛋白具有高度正相关,其中与收缩压的相关系数为0.751(p=0.000),与舒张压的相关系数为0.737(p=0.000),与随机尿蛋白的相关系数为0.554(p=0.000),与24小时尿蛋白总量的相关系数为0.472(p=0.004)；妊娠期高血压疾病组患者尿液中NGAL含量与患者血压及尿蛋白具有正相关,其中与收缩压的相关系数为0.471(p=0.000),与舒张压的相关系数为0.466(p=0.000),与随机尿蛋白的相关系数为0.524(p=0.001),与24小时尿蛋白总量的相关系数为0.386(p=0.022)。3、NGAL与疾病严重程度的相关性通过对三组样本血液与尿液NGAL水平比较我们发现,NGAL含量变化均随着病情严重程度加重而升高,行相关性分析结果示：血NGAL与疾病严重程度的相关系数为0.934(p=0.000),尿NGAL与疾病严重程度的相关系数为0.693(p=0.000)。血液NGAL与尿液NGAL均与疾病严重程度相关,血液NGAL的相关性大于尿液NGAL。[结论]不同严重程度妊娠期高血压疾病患者血液和胎盘组织中NGAL的表达具有差异,NGAL的含量随着患者血压和尿蛋白的升高而增加,进一步分析证实NGAL含量与疾病的严重程度高度相关,血液NGAL可以作为预测疾病严重程度的一个重要的指标。第三章早发型子痫前期患者NGAL表达及临床特征的相关性分析[目的]早发型子痫前期是妊娠期高血压疾病的一种特殊类型,具有发病早、程度重、并发症多、母儿预后不良等特点,严重威胁母婴健康及生命安全。本研究通过检测早发型子痫前期患者血液、尿液及胎盘组织中NGAL的含量,探求NGAL在早发型子痫前期发生和发展中的作用,并结合其临床特征进行相关性分析,为监测疾病进展及治疗效果提供可靠的依据。[方法]1、实验分组：选择2009年3月至2009年12月在南方医院及深圳市妇幼保健院因妊娠期高血压疾病住院的孕妇共86例,排除慢性高血压史、妊娠期糖尿病或糖尿病合并妊娠、感染、慢性肾炎、红斑狼疮史、自发性胎膜早破、胎儿生长受限、胎儿畸形及辅助生殖等因素后,共获得晚发型子痫前期17例,早发型子痫前期12例,所有诊断均在分娩12周后最终确诊。选择同期足月妊娠并分娩健康新生儿的孕妇为正常对照组共30例。2、标本采集：两组均于入院24小时内抽肘静脉血3ml,于入院第2日取晨尿3ml,于分娩时胎盘娩出后,立即取近脐根部母体面胎盘组织2.0cm x 1.0cm x0.2cm,平均分成两个部分,一部分与经过处理后的血液和尿液标本置入-80℃冰箱保存备用,另一部分置入4%甲醛4℃保存备用。3、NGAL的检测：采用ELISA试剂盒检测两组孕妇血液和尿液中NGAL,免疫组化法和Western Blot法检测胎盘组织中NGAL的表达。4、SPSS13.0进行统计学分析,应用单因素方差分析Welch法检测方差齐性,因方差不齐应用Games-Howell进行组间多重比较,p<0.05有显著性差异。[结果]1、早发型子痫前期组患者血液及尿液中NGAL的表达早发型子痫前期组血液中NGAL含量为796.1254±115.9243mg／L,尿液中NGAL含量为154.2859±42.1187mg／L；晚发型子痫前期组血液中NGAL含量为567.3348±195.9752mg／L,尿液中NGAL含量为113.9165±40.4284mg／L；正常对照组血液中NGAL含量为136.1140±28.5699mg／L,尿液中NGAL含量为75.1449±10.1471mg／L。早发型子痫前期组血液及尿液中NGAL含量与晚发型子痫前期组及正常对照组比较均有显著性差异(P=0.000),早发型子痫前期组NGAL含量较晚发型子痫前期组显著升高。2、早发型子痫前期组患者胎盘组织中NGAL的表达免疫组化及Western blot结果显示早发型子痫前期患者胎盘组织中有大量NGAL的表达。[结论]早发型子痫前期组患者体内的NGAL异常高表达,与其血压高以及尿蛋白迅速增加的临床特点相符,可能提示这类患者存在严重的内皮细胞功能障碍及全身系统性炎性反应。NGAL在判别早发型子痫前期患者病情严重程度及监测妊娠期肾功能损伤中具有重要意义。第四章NGAL在妊娠期高血压疾病临床诊断和治疗中的应用[目的]通过前期研究发现NGAL在妊娠期高血压疾病患者中过度表达且与病情的严重程度高度相关,下一步我们拟量化NGAL在妊娠期高血压疾病发生和发展中的作用,为预测疾病发生、监测疾病进展及治疗效果提高可靠的依据。[方法]1、行ROC曲线分析2、利用逐步判别分析法建立预测疾病严重程度的公式；3、进行回代性考核、交叉核实法及前瞻性考核验证公式的有效性。[结果]1、ROC曲线分析结果：血液NGAL的曲线下面积为1(p=0.000,95%可信区间在1.0～1.0),筛查界值为88.582 mg／L；尿液NGAL的曲线下面积为0.874(p=0.000,95%可信区间在0.791～0.957),筛查界值为52.512 mg／L2、判别分析法建立的预测公式及判别函数：两个变量：入院时首次发病时间为X天,入院后测血NGAL为Y mg／L步骤一：将变量代入公式Function 1=X·(-0.028)+Y·0.021+(-2.680) Function 2=X·0.103+Y·0.008+(-30.280)步骤二：将Function 1和Function 2代入函数,初步判定疾病的严重程度。妊娠期高血压：Function 1<0, Function 2<0;轻度子痫前期：Function 1<0, Function 2>0;重度子痫前期：Function 1>0。3、检验公式：对公式进行回代性考核准确率为100%；交叉核实法准确率达96.2%；前瞻性考核准确率达66.67%(4／6)。[结论]NGAL对于妊娠期高血压疾病具有较好诊断价值,结合NGAL与临床特征建立的预测疾病严重程度的判别公式能够初步评估妊娠期高血压疾病患者的病情,监测疾病的进展和治疗效果,为临床的诊断和治疗提供依据。全文小结1、妊娠期高血压疾病患者妊娠晚期血液、尿液及胎盘组织中均有NGAL的表达,较正常妊娠妇女有显著性升高。其中同一患者血液及尿液中NGAL具有一定相关性。2、不同严重程度的妊娠期高血压疾病患者体内的NGAL含量有显著性差异,NGAL与患者血压和尿蛋白具有正相关性,随着血压升高,尿蛋白含量增加,NGAL也随之升高；血液中NGAL含量与疾病的严重程度高度相关。3、早发型子痫前期组患者体内的NGAL异常高表达,提示这类患者存在严重的内皮细胞功能障碍及全身系统性炎性反应。NGAL在判别早发型子痫前期患者病情严重程度及监测妊娠期肾功能损伤中也具有重要意义。4、NGAL对于妊娠期高血压疾病具有较好诊断价值,结合NGAL与临床特征建立的预测疾病严重程度的判别公式能够初步评估妊娠期高血压疾病患者的病情,监测疾病的进展和治疗效果,为临床的诊断和治疗提供依据。5、NGAL在妊娠期高血压疾病的发生和发展中均具有重要意义：血液中NGAL水平可以筛查疾病的发生,预测疾病的严重程度；尿液中NGAL可以作为协助诊断妊娠期肾功能损伤的参考因素；胎盘组织中NGAL可能与妊娠期高血压疾病的发生有关,可以作为鉴别慢性高血压／慢性肾炎是否合并妊娠期高血压疾病的参考因素。