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研究背景骨组织工程可为修复大段骨缺损提供新的材料来源,近年来成为骨组织工程研究的热点。尽管近年来骨组织工程领域已经取得很大的进展,但仍存在一些需要解决的问题;其中,种子细胞的存活是目前制约骨组织工程研究与应用的一个重要原因。影响种子细胞在宿主体内存活的原因是多方面的,越来越多的研究表明缺氧是最为关键的因素之一。因此,通过制备一种能可控、缓慢、持续的释氧材料来提高种子细胞在骨组织工程支架材料中的存活率,这将为组织工程在骨缺损,尤其是大块骨缺损的修复方面提供新的策略。目前在骨组织工程中少见利用释氧材料的报道,且释氧材料应用相对不成熟。研究目的利用明胶Gelatin、CaO2为原材料,采用乳化-化学交联法制备Gelatin-CaO2释氧微球并检测其释氧性能;将Gelatin-CaO2释氧微球与纳米自聚合肽水凝胶(self-assembling peptide nanofiber scaffold,SAPNS)、PLGA 膜结合,构成Gelatin-CaO2/SAPNS/PLGA释氧复合支架材料,检测该释氧复合支架材料在低氧条件下对种子细胞存活的影响及其体内成骨修复效果,从而为骨组织工程材料在大块骨缺损修复中提供实验基础,同时为临床骨缺损的修复提供一种新的思路。主要研究方法1.Gelatin/CaO2可控缓慢释氧微球的制备Gelatin 溶于加热的 PBS,按Gelatin:CaO2=2:1向 Gelatin 的 PBS 液中加入CaO2粉末,充分混悬,随后将混悬液快速加入在加热磁力搅拌器上高速搅拌的液体石蜡中,同时加入50%戊二醛交联,低温下搅拌使微球进一步固化;异丙醇、丙酮、乙醇除去微球上附着的石蜡及戊二醛,冷冻干燥后密封保存。2.Gelatin-CaO2释氧微球释氧效能检测体外释氧检测时,将75 mg释氧微球置于15ml离心管中,加入3 ml PBS液混匀。分别在1D 3D 5D 7D 10D 14D 17D 21D 28D用溶氧仪检测PBS的氧含量。体内释氧检测时,将Gelatin-CaO2释氧微球移植于新西兰大白兔的双侧股骨外侧髁,分别在第1W、2W、3W、4W将复合材料取出检测其释氧效果。3.Gelatin-CaO2释氧微球体外低氧条件下促进细胞存活检测实验组:Gelatin-CaO2组,对照组:空白组、Gelatin微球组、纯CaO2组。在直径为10 cm的圆形培养皿中加入细胞悬液,3h后,弃原培养基,加入经缺氧处理后的新培养基,并按实验分组加入处理因素,置于低氧条件下培养3d后进行流式细胞凋亡检测。4.Gelatin-CaO2/SAPNS/PBMSC/PLGA释氧复合支架材料的制备和移植Gelatin-CaO2/SAPNS/PBMSC/PLGA复合支架材料制备方法如下:将准备好的PBMSCs重悬于15μl的DMEM/F12培养基中,迅速将细胞悬液在低温下与Gelatin-CaO2微球、100μ1 SAPNS混合,置于PLGA膜上,随后盖上另一片PLGA膜。将上述准备好的Gelatin-CaO2/SAPNS/PBMSC/PLGA复合系统植入极限颅骨缺损模型中作为实验组。同法处理PBMSC/SAPNS/PLGA组、Gelatin/SAPNS/PBMSC/PLGA 组、CaO2/SAPNS/PBMSC/PLGA 组的移植材料。5.检测 Gelatin-CaO2/PBMSC/SAPNS/PLGA 体内促进 PBMSCs 在体内存活2W后,每组分别随机取3只大鼠进行灌注取材,冰冻切片后,进行常规BrdU、DAPI免疫荧光染色,并计算BrdU的阳性率。6.影像学和组织学检测骨组织再生术后10W,Micro-CT扫描、三维重建取材标本。通过软件分析标本的骨密度(Bone Mineral Density,BMD)、骨体积(Bone Volume,BV)。随后将标本进行进行组织学染色观察。7.研究结果统计学分析:本研究所有数据均采用SPSS20.0软件进行统计学单因素方差分析(one-way ANOVA)进行组间比较,数值用均数士标准差表示。以p<0.05时差异具有统计学意义。主要研究结果1.Gelatin-CaO2释氧微球具有缓慢、持续、可控释氧效能体外释氧检测显示,本实验制备的Gelatin-CaO2释氧微球可持续缓慢释氧超过3W;体内释氧检测显示,Gelatin-CaO2释氧微球释氧效果在同一时间点优于体外;两种释氧检测方法均未发现明显的突释现象。2.Gelatin-CaO2释氧微球在低氧条件下明显促进细胞存活PBMSCs与释氧材料在体外缺氧条件下共培养3d后用流式细胞术检测凋亡情况:实验组细胞存活率明显高于对照组。体内实验部分,使用BrdU示踪法检测细胞存活及增殖情况,结果显示:实验组BrdU染色阳性细胞率远高于对照组。3.Gelatin-CaO2/PBMSC/SAPNS/PLGA复合支架材料促进极限颅骨缺损修复术后10W颅骨标本进行影像学检测结果表明Gelatin-CaO2/PBMSC/SAPNS/PLGA组骨缺损大部分被修复,而PBMSC/SAPNS/PLGA组、Gelatin/PBMSC/SAPNS/PLGA组修复效果大致相同,但仍存在大部分未修复的骨缺损;CaO2/PBMSC/SAPNS/PLGA组骨缺损修复效果较差,仅在骨缺损边缘发现少许新生骨组织。主要研究结论1.本实验成功制备出具有可控缓慢持续释氧特性的Gelatin-CaO2释氧微球,该微球能明显促进种子细胞在体内外低氧条件下存活;2.Gelatin-CaO2/SAPNS/PLGA释氧复合支架材料通过提高种子细胞的存活,从而提高了移植的复合支架材料的骨缺损修复效果,为骨缺损的修复提供新策略,具有良好的应用前景。