花生中黄曲霉毒素免疫层析快速定量技术研究

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黄曲霉毒素是一类由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的剧毒代谢产物,分布于农作物生长、收获、储运及产品加工等各个阶段。黄曲霉毒素作为迄今发现的已知毒性最强的天然化学致癌物质之一,不但严重威胁人畜健康,造成严重的经济损失,还极易引发社会恐慌,黄曲霉毒素污染已成为当前农产品及食品安全领域的研究热点和难点。建立粮油作物及制品中黄曲霉毒素快速定量检测技术对我国小农户分散性的粮油作物种植模式的国情具有重要意义,能为我国农产品,尤其是花生产品出口创汇、提高国际竞争力及保证我国消费者身体健康提供有力保障。本研究在研制出黄曲霉毒素胶体金免疫层析速测仪以及所创建的免疫层析快速定量模型的基础上,建立了花生中黄曲霉毒素快速定量检测技术,有效的提高了实验结果的重复性,解决了由金标抗体喷涂量的差异而引起的试纸条定量结果之间的变异较大的难题。本研究工作的主要结论如下:1.成功研制出黄曲霉毒素胶体金免疫层析速测仪。胶体金试纸条显色特征识别过程是一个包含了生化、光、电和软件处理的综合过程,本研究采用胶体金免疫层析试纸条作为一级传感器,面阵CMOS图像芯片作为二级传感器,采用现代光、机、电、计算机等技术手段,将黄曲霉毒素免疫层析快速检测试纸条的定性结果——即灰度信号经便携式胶体金免疫层析速测仪予以快速读取量化和直接表达,将灰度信息转换为图像信息,利用计算机视觉以及现代信息处理技术对图像处理分析,来获取待检测黄曲霉毒素的定量信息,终于成功研制出黄曲霉毒素胶体金免疫层析速测仪,用于黄曲霉毒素的免疫层析快速定量检测。2.首次建立了基于单抗技术的胶体金免疫层析快速定量检测技术模型,使定量结果重复性大大提高。基于实验室自主研发的黄曲霉毒素定性试纸条的特点(制备金标探针的抗体为黄曲霉毒素特异性单克隆抗体),通过提高C线二抗的标记量,使金标抗体全部固定在NC膜上的C线和T线处,在建立标准曲线时,选择(T+C)作为规范试纸条之间金标抗体喷涂量差异的标准因子,建立黄曲霉毒素快速定量检测模型,显著提高试纸条快速定量检测结果的重复性。该模型成功用于研究建立花生中黄曲霉毒素免疫层析快速定量检测技术。3.依照本研究所建立的免疫层析快速定量模型,基于自主研发的黄曲霉毒素胶体金免疫层析速测仪,建立了花生黄曲霉毒素B1的快速定量技术。对空白花生样品加标回收率在88%-119%之间,日间、日内分别重复三次,相对标准偏差(RSD)分布在6%-27%之间。实际花生样品中的检测限为0.9μg/kg,与HPLC法比对研究表明,两种方法相对误差在17%之内。4.按照本研究所建立的免疫层析快速定量模型,采用自主研发的黄曲霉毒素胶体金免疫层析速测仪,建立了花生黄曲霉毒素总量(B1+B2+G1+G2)的快速定量技术。加标回收率分别为日内71.26%-105.69%、日间94.86%-123.2%,日间、日内分别重复三次,精密度用相对标准偏差(RSD)表示,都分布在7.14%-18.14%之间。实际花生样品中的定量范围为0.081-20.84μg/kg,检测限为0.062μg/kg。与ELISA法进行比对分析表明,两种方法存在线性关系,线性回归方程为:y=0.967x+0.201(y为免疫层析定量检测技术研究所得结果,x为ELISA方法所得结果,R2=0.966)。两种方法结果相关性良好。本研究解决了黄曲霉毒素免疫层析分析技术无法满足快速定量应用上的难题,为有效监控黄曲霉毒素污染开辟了免疫快速检测方法新的途径,同时本研究建立的免疫层析快速定量技术具有简单、快速、成本低廉的特点,能满足我国基层检测机构完成对黄曲霉毒素污染的现场检测的要求。
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