烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶（Nicotinamide Adenine Dinucleotide Kinase,NADK）催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide,NAD+）磷酸化生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate,NADP+）,控制细胞内NADP+/NADPH的含量。与正常细胞相比,高度增殖的肿瘤细胞需要大量的NADP+/NADPH,用于核酸、蛋白质、脂质等生物大分子的快速合成以及中和过多的活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）。Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rats arcomaviral oncogene homolog,KRAS）激活突变是肿瘤中最为广泛存在的激活突变,尤其在肺癌、胰腺癌和结直肠癌中。研究表明,NADK敲低不影响正常细胞生长,也不影响KRAS野生型的肿瘤细胞的成瘤性或转化性生长。但是,敲低NADK的表达或抑制其酶活则可以显著降低KRAS激活突变的肿瘤细胞的成瘤性生长。这提示NADK参与由KRAS介导的肿瘤生长过程。因此,开发靶向NADK的小分子抑制剂有可能实现特异性杀伤KRAS激活突变的肿瘤细胞。但是,目前为止,KRAS调控NADK酶活的分子机制以及靶向NADK的小分子抑制剂还没有被报道。本课题通过蛋白质质谱、蛋白免疫共沉淀（Co-IP）、体外Pull down实验等方法,发现KRAS下游关键激酶细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinase 1/2,ERK1/2）可以直接结合NADK蛋白;通过蛋白质修饰质谱、体外磷酸化和细胞内磷酸化实验发现ERK1/2激酶可以磷酸化NADK的第48位和50位的丝氨酸残基（NADK-S48/50）。进一步的体外和细胞内酶活性实验发现NADK-S48/50的磷酸化可以显著激活NADK酶活性。该研究结果揭示KRAS调节NADK酶活性和细胞内NADP+/NADPH水平的关键作用机制。同时,我们通过建立和优化基于NADK酶活的高通量筛选方法（Z factor为0.71）,对实验室自建的天然产物化合物库进行筛选,发现一个NADK抑制剂（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）,其抑制活性IC50值为1.3±1.1μM。一维核磁共振（NMR）实验结果显示EGCG可以与NADK直接结合。表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance,SPR）实验测定EGCG与NADK的结合亲和力Kd值为1.78±1.15μΜ。通过竞争性实验发现EGCG是一种非竞争性抑制剂,Ki=3.28±0.32μΜ。为了探究EGCG在NADK上的结合位点,我们进行了氢氘交换质谱（Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry,HDX-MS）实验,结果显示EGCG结合在NADK的非底物结合位点。另外,结合模式预测和衍生物活性分析研究揭示了EGCG和NADK之间潜在的构效关系（Structure activity relationships,SAR）。此外,发现EGCG可以特异性抑制KRAS激活突变的肺癌细胞的增殖,而对KRAS野生型肺癌细胞增殖没有影响。综上所述,本课题以NADK为研究对象,首次发现NADK是ERK1/2激酶的底物蛋白,ERK1/2可以磷酸化NADK-S48/50激活其酶活性。我们构建高通量筛选平台并发现天然产物EGCG是NADK的非竞争性抑制剂。EGCG可以特异性抑制KRAS激活突变型肺癌细胞增殖,这为后续NADK靶向药物开发奠定良好的研究基础。