【摘 要】
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研究背景乳腺癌已成为全球第一大癌症,且其死亡人数也位于女性癌症死亡人数的首位。因此,虽然乳腺癌的综合治疗手段已得到了很大程度的发展和完善,但乳腺癌的复发、转移和耐药依然是全球女性健康的巨大杀手。雌激素受体阳性乳腺癌约占乳腺癌总数的70%,其治疗的主要阻碍是内分泌治疗的耐药,这一问题一直存在,亟待解决。MCM6（微染色体维持蛋白6,minichromosome maintenance 6）是MCM家
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研究背景乳腺癌已成为全球第一大癌症,且其死亡人数也位于女性癌症死亡人数的首位。因此,虽然乳腺癌的综合治疗手段已得到了很大程度的发展和完善,但乳腺癌的复发、转移和耐药依然是全球女性健康的巨大杀手。雌激素受体阳性乳腺癌约占乳腺癌总数的70%,其治疗的主要阻碍是内分泌治疗的耐药,这一问题一直存在,亟待解决。MCM6（微染色体维持蛋白6,minichromosome maintenance 6）是MCM家族重要成员之一,对细胞的DNA复制至关重要,在多种癌症中发挥着促癌作用。但在乳腺癌中对MCM6的研究鲜有报道,MCM6在乳腺癌中的作用及其具体机制有待阐明。研究目的探究MCM6在雌激素受体阳性乳腺癌细胞中对细胞增殖的影响,并深入研究MCM6在此类型乳腺癌中发挥作用的具体机制。研究方法（1）通过WGCNA生物信息学分析方法及文献阅读筛选感兴趣的差异基因MCM6作为研究靶点。并使用网络在线数据库Oncomine和Ualcan分析MCM6在乳腺癌及癌旁组织中的差异表达,及其在不同分子分型的乳腺癌中与预后的相关性。使用卡方检验分析了TCGA数据库中MCM6与乳腺癌临床病理特征的相关性。（2）在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞MCF7及T47D中通过转染si RNA人为敲低细胞中MCM6的表达。使用western blot及q RT-PCR技术在蛋白及m RNA水平验证敲低效果,选择合适的si RNA序列构建慢病毒,通过慢病毒转染构建稳定敲低MCM6的乳腺癌细胞株。CCK8细胞增殖实验、克隆形成实验、Edu实验及裸鼠皮下成瘤实验用于在体外和体内检测MCM6敲低组细胞与对照组细胞之间增殖能力的差异,流式细胞周期检测用于检测实验组与对照组细胞周期的分布情况。（3）通过GEO数据库数据分析E2/ER对MCM6 m RNA水平的影响,western blot检测加入雌激素后ER+乳腺癌细胞中MCM6蛋白水平的变化情况。（4）应用PROMO及JASPAR数据网站对能够结合MCM6启动子序列的转录因子及MCM6启动子序列与ER转录结合位点进行预测后,通过Ch IP实验检测ER与MCM6启动子预测位点的结合情况。（5）对对照组及MCM6敲低组稳转细胞株进行转录组测序以探索MCM6参与影响的主要信号通路,并通过western blot检测该通路蛋白水平的变化。在ER+乳腺癌细胞系MCF7中使用MCM6抗体进行co-IP实验后进行蛋白组学的质谱分析,并应用western blot对质谱结果中的蛋白分子进行验证。研究结果（1）MCM6在乳腺癌组织中表达高于癌旁组织,其表达高低与乳腺癌ER/PR/HER2状态及预后存在相关性,且在不同的分子分型的乳腺癌中与预后的相关性存在差异,其中在ER+乳腺癌中的相关性最显著。（2）敲低雌激素受体阳性乳腺癌细胞中的MCM6后癌细胞阻滞于细胞周期的S期,细胞增殖能力明显降低。（3）雌激素作为配体使ER激活后,ER可与MCM6基因启动子序列的部分位点结合发挥其转录因子功能,从而促进MCM6基因的转录。（4）MCM6主要发挥着对PI3K/AKT及其下游信号通路的影响,敲低MCM6可对该通路产生抑制作用。MCM6可与包括GINS3蛋白在内的多种蛋白分子结合形成复合物发挥其生物学功能。研究结论本研究首次深入探究了MCM6在ER+乳腺癌中对细胞增殖的调控及其调控机制。我们发现,雌激素作为配体激活雌激素受体后,雌激素受体可作为转录因子结合MCM6的启动子序列促进MCM6的转录。MCM6转录表达升高后与GINS3等相关蛋白结合形成复合体发挥功能,向下游传递更多的激活信号使PI3K增多,继而该通路激活增多,从而促进了癌细胞增殖。鉴于上述调控关系,我们认为MCM6或许可以成为ER+乳腺癌内分泌治疗耐药后又一有效的联合治疗的新靶点,为未来乳腺癌患者治疗方式的选择提供新的可能性。
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