目的昆明山海棠[Tripterygium Hypoglaucum (Levl.) Hutch,THH]为卫矛科雷公藤属植物,祖国传统医药取其全根、去皮根、根皮及茎枝等入药。研究显示THH总生物碱(THHta)具有明显的体外抗肿瘤活性,能诱导肿瘤细胞周期阻滞和细胞凋亡,深入研究THHta的抗肿瘤活性及其物质基础对THHta的开发研究十分必要。以THH去皮根中试提取制备THHta,研究其体外、体内抗肿瘤活性。确证THHta抗肿瘤活性后研究其抗肿瘤活性的机制及其主要成分,为基于THHta的抗肿瘤药物开发提供实验依据及开发方向参考。方法(1) THHta提取:基于文献及实验室提取方法,与辽宁本溪国家中成药工程技术研究中心合作进行中试规模提取。按照药典中THH总生物碱的鉴定反应进行定性。(2) THHta的抗肿瘤活性:选用敏感的肿瘤细胞株HL60、MOLT-4、HCT116及PC3,利用MTT、软琼脂集落形成实验研究THHta的体外抗肿瘤活性。利用HCT116裸鼠移植瘤模型评价THHta的体内抗结肠癌活性。(3) THHta致突变作用:利用Ames试验检测THHta的致突变作用。(4) THHta抗肿瘤作用机制研究:利用流式细胞术检测THHta对HCT116细胞周期及细胞凋亡的影响。利用western blot及免疫组化检测细胞周期及凋亡相关的部分蛋白表达情况,探讨THHta抗肿瘤活性的作用机制。(5) THHta活性部位主要成分的分离分析及结构鉴定:结合薄层层析(TLC)检测,运用硅胶吸附层析、制备高效液相色谱(HPLC)技术,对THHta活性部位进行分离、纯化得到化合物单体。结合理化常数的测定,利用IR、1HNMR、13CNMR等技术结合文献数据对单体化合物进行鉴定。结果(1)中试提取THHta得率为0.76‰,初步鉴定为生物碱。(2)中试提取的THHta抑制HL60、MOLT-4、HCT116及PC3细胞的增殖,呈明显的量效、时效依赖关系。中试THHta作用MOLT-4、HL60、HCT116及PC3细胞48h对应的IC50值为1.62±0.12、9.01±1.10、19.11±6.34、50.91±11.41 ug/ml,作用HCT116、PC3细胞72h对应的IC50值为3.59±0.86、21.62±1.88 ug/ml。实验室提取THHta作用MOLT-4、HL60、HCT116及PC3细胞48h对应的IC50值为1.95±0.45、9.33±0.24、21.93±5.36、40.14±1.20μg/ml,作用HCT116、PC3细胞72h对应的IC50值为3.50±0.61、18.55±1.38μg/ml。中试提取的THHta能诱导MOLT-4、HL60细胞周期阻滞于G0/G1,能诱导MOLT-4细胞凋亡。(3) THHta各剂量组(27、135、675ug/皿)对鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100和TA102诱发的回变菌落数,在±S9条件下,均未超过对照组2倍。THHta对鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100和TA102无直接和间接致突变作用。(4) THHta能显著抑制TPA诱导的JB6 CI41转化细胞集落形成(P<0.01),呈量效依赖关系。1.25、2.5、5.0和10μg/ml THHta对TPA诱导的JB6 CI41转化细胞集落形成抑制率为:54.4%、84.7%、97.8%和99.8%。(5) THHta显著抑制HCT116细胞的锚着非依赖性生长(P < 0.01),呈量效依赖关系。0.625、1.25、2.5、5.0和10μg/ml THHta对HCT116细胞集落形成的抑制率为:53.5%、74.0%、89.5%、92.2%和94.6%;IC50值为0.44μg/ml。(6) THHta能够抑制HCT116裸鼠移植瘤生长。治疗组HCT116裸鼠移植瘤的平均体积与对照组相比,在给药第6天后,200 mg/kg THHta组瘤体积显著小于对照组,出现统计学差异(P <0.01);在给药第9天至实验结束100、200mg/kg THHta治疗组平均瘤体积均显著小于对照组(P <0.01)。实验结束时,对照组、100mg/kg THHta、200mg/kg THHta组HCT116裸鼠移植瘤的平均体积分别是给药时瘤体积的9.39倍,1.93倍和0.83倍。THHta 100mg/kg组在给药后第9、12、15、18、21、24天的相对肿瘤增殖率(T/C %)分别为49.5%、31.4%、31.8%、21.3%、18.5%、20.5%; 200mg/kg THHta组在给药后第6、9、12、15、18、21、24天的T/C值分别为45.4%、31.7%、26.6%、17.9%、15.4%、11.9%、8.9%。由100mg/kg、200mg/kg THHta组的T/C值可知,THHta抑制HCT116裸鼠移植瘤的增殖,且与时间和剂量呈依赖关系。实验结束时100mg/kg、200mg/kg THHta组的平均瘤重为0.72±0.27g和0.36±0.17g,与对照组1.82±0.49g比较,治疗组移植瘤平均重量均显著轻于对照组(P<0.01)。THHta 100mg/kg、200mg/kg对HCT116裸鼠移植瘤的瘤重抑制率分别为60.4%和80.2%。(7) THHta治疗组与对照组荷瘤裸鼠的平均体重变化趋势一致,随实验时间延长,裸鼠体重减轻。实验结束时,荷瘤裸鼠体重与实验开始时相比,对照组降低了16.8%,THHta 100 mg/kg治疗组降低了13.9%,而200 mg/kg组降低了24.2%。THHta治疗组的荷瘤裸鼠心、肝、脾和肾脏的脏器系数与对照组之间比较均无明显差异(P > 0.05)且数值十分接近。各组荷瘤裸鼠心、肝、脾和肾的HE染色组织切片光学显微镜下观察均无肿瘤转移及器质性改变。(8) THHta对HCT116细胞周期及凋亡均有影响。0、10、20、40μg/ml THHta作用经血清饥饿法同步化的HCT116细胞24h, HCT116细胞中G0/G1期比例为73.6%、81.4%、85.6%、83.0%,显示THHta能导致HCT116细胞中G0/G1期比例增加。10μg/ml THHta作用HCT116细胞12、24h、36h亦能引起HCT116细胞中G0/G1期比例增加。THHta能诱导HCT116细胞凋亡,10μg/ml THHta作用HCT116细胞12h、24h和36h诱导的凋亡细胞比例增加与时间呈依赖关系,36h凋亡细胞比例为20.4%。(9) Western blot结果显示,THHta能改变HCT116细胞G1/S期调控蛋白表达。THHta(1.25-10μg/ml)作用HCT116细胞12h、24h、36h、48h,c-Myc蛋白的表达逐渐减弱,且与时间和剂量呈依赖关系。1.25-5.0μg/ml THHta作用HCT16细胞36h能使P21蛋白表达增强。与对照组比较,10μg/ml THHta引起HCT116细胞Cyclin D1蛋白的表达减弱;CDK4蛋白表达在36h时相点,随THHta浓度增加表达减弱;CDK6蛋白表达在36h、48h时相点,随THHta浓度增加表达减弱。(10) Western blot结果显示,THHta能改变HCT116细胞凋亡相关蛋白表达。10μg/ml THHta处理HCT116细胞12h、24h、36h、48h,与对照组比较活化的PARP蛋白、活化的Caspase 3蛋白、活化的Caspase 8蛋白表达明显增强,且与时间和剂量呈一定依赖关系。2.5-10μg/ml THHta作用HCT116细胞36h、48h能减弱抑凋亡蛋白Bcl 2、Bcl-xl、XIAP的表达。(11)免疫组化检测结果显示,THHta体内能够抑制HCT116移植瘤细胞PCNA、突变P53蛋白的表达,而对P21、P27蛋白表达有增强作用。(12)THHta活性部位中初步分离分析并鉴定出以下9个单体化合物:木栓酮醛、齐墩果酸乙酸酯、雷公藤内酯乙、雷公藤内酯甲、雷公藤次碱、雷公藤定碱、雷公藤吉碱、β-谷甾醇和胡萝卜苷。结论中试提取THHta方法可行,得率较实验室提取方法高。中试提取的THHta(ZS-THHta)体外具有明显的抑制MOLT-4、HL60、HCT116和PC3细胞增殖活性,且与时间和剂量呈依赖关系,与实验室提取THHta的体外抗肿瘤活性无明显差异。ZS-THHta能够诱导MOLT-4、HCT116细胞周期阻滞于G0/G1期及细胞凋亡。ZS-THHta第三军医大学博士学位论文能够抑制HCT116细胞裸鼠移植瘤生长,具有显著的体内抗结肠癌活性。ZS-THHta诱导HCT116细胞G0/G1期阻滞与下调c-Myc、Cyclin D1、CDK4、CDK6、及上调P21蛋白表达相关。ZS-THHta诱导HCT116细胞凋亡主要与细胞凋亡外在途径激活及下调抑凋亡蛋白Bcl 2、Bcl-xl、XIAP表达相关。结合THHta抗肿瘤活性、分离鉴定的单体化合物及体外抗肿瘤活性初筛结果,THHta具有作为二类抗肿瘤中药新药的研究价值。