水稻逆境相关基因的遗传转化和功能鉴定

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非生物逆境胁迫,如干旱、盐及低温等是影响植物生长发育的主要因素,严重影响农作物产量,甚至导致植物死亡。利用基因工程手段提高植物的抗逆性已成为现代农业的一项重要研究内容。在非生物逆境胁迫条件下,信号传导过程中的关键基因能够调节信号传导和功能基因的表达,一些重要的调节基因和功能基因在转基因株中的超量表达,往往能使植物获得更强的抗逆性。本研究以水稻为材料,开展了水稻逆境相关基因的研究。在分析5个抗逆候选基因的逆境表达、组织特异性表达的基础上,构建了遗传转化载体并进行水稻遗传转化,系统地进行了超表达、拷贝数检测,转基因水稻抗旱、耐盐性鉴定,并分离鉴定了逆境诱导基因OCPI1的启动子,为抗逆转基因水稻的培育以及水稻抗逆机理研究提供了大量有参考价值的数据和结论。研究获得的主要结果如下:1.对5个逆境诱导表达基因(本文称候选基因)构建了12个遗传转化载体并转化水稻品种中花11。2.分析了5个候选基因干旱、盐胁迫和脱落酸(ABA)处理下的诱导表达量,其中3个基因,OsCK1(编码一个CIPK家族的蛋白激酶),OsDhnI(编码一个脱水素同源蛋白)和OCPI1(编码一个蛋白酶抑制子)的表达被多种逆境胁迫强烈诱导,表现出很大的逆境相关性,因此确定为本研究的重点研究基因。3.对候选基因产生的全部T0转基因植株进行了PCR阳性检测(90%植株为阳性),对7个超表达载体产生的总计139棵转基因阳性植株进行了超量表达检测(不同construct的转基因植株超表达率大约都在50%—60%之间),确定了81个超表达的家系。检测了55个超量表达家系的拷贝数(单拷贝的比例在30%以上),确定了超表达、单拷贝的转基因家系。4.对OsCK1,OsDhnI,OCPI1的超表达、单拷贝转基因家系于武汉、海南进行了孕穗至开花期的田间干旱胁迫,考种后结果显示OsDhnI、OCPI1转基因植株产量及结实率均显著高于对照中花11,同时这2个基因的超表达转基因家在含盐(100 mM NaCl)培养基上也显示了比对照更强的耐盐性,表明超表达OsDhnI、OCPI1有助于水稻抗逆性的提高。对OCPI1转基因植株进行酶活测定,发现其内源糜蛋白酶受到了一定的抑制。5.分离了候选基因OCPI1的启动子,对该启动子控制的GUS报告基因的转基因水稻植株的多种组织进行了GUS染色,发现GUS在所检测的组织中均有一定程度的表达。对该启动子的转基因植株进行Northern及GUS定量分析发现该启动子具有很强的干旱和盐胁迫诱导活性,并且用该启动子序列的反义链构建的GUS融合载体转化水稻后亦检测出很强的干旱和盐胁迫诱导活性,表明此启动子具有双向逆境诱导活性。6.对OsCK1候选基因cDNA进行了定点诱变,期望突变基因编码的蛋白具有组成型激酶活性,目前已将突变基因在水稻中超表达并获得了单拷贝家系以备进一步的抗逆性鉴定和激酶活性分析。
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