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ε-聚赖氨酸(ε-PL)是一种均聚氨基酸,是目前一种新型生物防腐剂,它与传统的化学防腐剂相比,具有安全性高、抑菌谱广、热稳定性强等优良特性。其应用领域也在不断扩大,在生产可生物降解的生物材料、某些药物的包装物制作,靶向药物载体及医药研究等方面均有重要用途。本课题立足从长白山区的林下土壤中筛选到一株产ε-聚赖氨酸的菌株,对其进行菌种鉴定,优化其发酵条件,对发酵产物ε-PL进行分离纯化,并研究其抑菌特性及抑菌机理,通过质粒消除的方法来初步探索菌株合成ε-PL的生物合成途径。
本项研究从长白山区林下土壤中筛选到一株产ε-聚赖氨酸的菌株,通过Itzhaki方法测定ε-PL的含量及抑菌实验最终确定菌株110-6就是产具有生物活性的ε-PL菌株。把菌株110-6作为出发菌株,对其进行菌种鉴定和分类。根据菌株110-6的生理生化特征,鉴定其属于链霉菌属(Streptomyces)。对菌株110-6的16SrDNA基因序列进行Blast同源序列分析并与11株链霉菌进行系统发育分析,结果表明菌株110-6与白色链霉菌(Streptomyces albus)属于同一属菌,我们将其命名为白色链霉菌110-6(Streptomyces albus110~6)。
对实验菌株进行培养条件优化,采用单因素和正交实验结合的方法,最终确定了最佳培养基配方为:葡萄糖5%,硫酸铵15%,酵母膏1%,MgSO<,4>0.125%,K<,2>HPO<,4>0.15%,KH<,2>PO<,4>0.15%。最佳产ε-PL发酵条件为:装液量为50ml/500ml三角瓶,初始pH值为6.0,接种量为7%,发酵温度为30℃。用SPSS软件分析方差,得到各因素影响发酵产物产量的显著程度依次为葡萄糖>硫酸铵:酵母膏>MgSO<,4>>K<,2>HPO<,4>>ZnSO<,4>/FeSO<,4>>KH<,2>PO<,4>。
采用阳离子交换层析的方法对菌株S.a 110-6发酵产物ε-PL进行分离纯化,对提纯的ε-PL浓缩液进行氨基酸组分的分析,结果表明活性物质就是ε-聚赖氨酸。对ε-PL进行了生物活性的测定,结果表明菌株S.a110-6所产的聚赖氨酸对细菌、霉菌、酵母都有一定的抑菌活性。本实验还对ε-PL浓缩液的耐热性和耐酸碱性进行了研究,实验结果表明,提取液有很强的耐热性和耐酸性。
对菌株S.a 110-6产ε-PL生物合成途径进行了的探索。通过消除质粒,并测定质粒消除菌株的抑菌活性,初步确定了菌株S.A110-6的质粒与ε-聚赖氨酸的生物合成有关。