猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）自发现以来,给我国养猪业带来重大经济损失。病毒自身的免疫逃逸和基因组的高变性,使其到目前为止仍不能被有效防控。而深入研究PRRSV与宿主的相互作用,发掘宿主抗病毒机制以及PRRSV的免疫逃逸策略,对PRRSV新型疫苗研制、药物开发和防控措施制定具有重要意义。DEAD-box（DDX）家族蛋白是一类三磷酸腺苷（ATP）依赖的RNA解旋酶,广泛参与宿主细胞的RNA剪接、转录、翻译等多种生命活动,而且越来越多的研究证实DDX参与天然免疫调控和病毒复制,是当前研究的热点。目前,关于DDXs调控PRRSV的复制及其机制的研究比较少。为了系统研究DDX在调控PRRSV复制中的作用,本研究利用表达绿色荧光蛋白（EGFP）的重组PRRSV筛选可影响PRRSV增殖的DDX蛋白,并对其中显著促进或抑制PRRSV增殖的DDXs进行深入研究。主要研究内容如下:1.筛选调控PRRSV增殖的DDXs蛋白将40个编码DDX蛋白的真核表达质粒分别转染MARC-145细胞,然后感染带有EGFP标签的重组PRRSV（r HP-PRRSV/SD16/TRS6-EGFP）,通过流式细胞术检测PRRSV的感染情况,结果发现DDX21、DDX4、DDX27显著促进PRRSV增殖,而DDX10、DDX49显著抑制PRRSV增殖。进一步通过实时荧光定量RT-PCR对促进或抑制PRRSV增殖的DDXs进行验证,结果与流式细胞术分析一致。综合考虑所筛选到的DDXs对PRRSV增殖的调控作用（促进或抑制）以及当前国际上对这些DDXs研究的深入程度,选择可显著促进PRRSV增殖的DDX21以及显著抑制PRRSV增殖的DDX10进行下一步深入研究。2.DDX21促进PRRSV增殖的机制研究为了进一步确定DDX21促进PRRSV增殖的生物学效应,采用过表达和si RNA干扰两种方式,结合IFA、Western blot、q RT-PCR和TCID50分析,证实过表达DDX21显著促进PRRSV增殖,而干扰内源性DDX21的表达显著抑制PRRSV增殖。同时,构建了DDX21的三种酶活突变体并评价其对PRRSV增殖的影响,发现DDX21促进PRRSV增殖不依赖于其ATP酶活性、RNA解旋酶活性以及RNA折叠酶活性。在分析DDX21调控PRRSV增殖的同时,也分析了PRRSV感染对DDX21表达的影响,发现PRRSV感染显著上调DDX21的m RNA和蛋白表达,且呈时间和剂量依赖性。为了确定PRRSV编码的哪些蛋白能够与DDX21相互作用并影响其表达,通过Co-IP实验全面分析了PRRSV编码蛋白与DDX21的相互作用,结果发现PRRSV编码的非结构蛋白nsp1α、nsp1β、nsp4、nsp12以及结构蛋白N（核衣壳蛋白）与DDX21存在相互作用,而且nsp1β显著上调DDX21的m RNA和蛋白表达。通过构建DDX21不同结构域的截短突变体,确定DDX21的C端是其与nsp1β互作的关键结构域。同时,还发现DDX21显著上调nsp1α、nsp1β以及N蛋白的表达,而这3个蛋白是已知的β干扰素（IFN-β）的拮抗剂。另外,分析了PRRSV感染条件下DDX21是否通过调控IFN信号通路影响病毒的增殖,结果发现干扰DDX21表达显著激活IFN-β信号通路并诱导干扰素刺激基因（ISGs）表达。上述结果表明,DDX21可通过下调IFN-β和ISGs表达、上调病毒编码的IFN拮抗蛋白表达以及与病毒蛋白相互作用等多种机制促进PRRSV增殖。3.DDX21负调控IFN-β产生的机制研究鉴于DDX21抑制IFN-β产生,促进PRRSV增殖,对DDX21调控IFN产生的机制进行进一步研究。通过过表达和si RNA干扰,证实DDX21负调控仙台病毒（Se V）诱导的IFN-β产生,且不依赖其ATP酶活性、RNA解旋酶活性和折叠酶活性。为了排除si RNA的脱靶效应和其它因素的影响,利用CRISPR/Cas9技术构建了敲除DDX21的HEK-293T细胞系。在DDX21敲除细胞和野生型细胞上比较Se V诱导IFN-β产生、ISGs表达以及RLR（RIG-I-like receptor）信号通路中关键信号分子或转录因子的表达及其磷酸化水平,发现敲除DDX21显著上调Se V诱导IFN-β产生、干扰素刺激基因（ISG15、Mx1、OAS1）的m RNA表达以及IKKε、IRF3、p65、STAT1、STAT2的磷酸化水平。同时,在DDX21敲除细胞系上过表达DDX21（回补实验）也证实DDX21负调控Se V诱导的IFN-β产生。为了确定DDX21负调控IFN-β产生的作用靶点,分析了DDX21对RLR信号通路的影响,发现过表达DDX21不影响RIG-I、MDA5、IPS-1、TBK-1、IKKε和IRF3诱导的IFN-β产生,提示DDX21的作用靶点可能位于RIG-I/MDA5或其上游。进一步通过敲除、过表达和Co-IP实验分析,发现DDX21并不影响RIG-I的表达,也不与RIG-I相互作用。RNA pull-down以及竞争性结合实验发现DDX21与RIG-I竞争性结合双链RNA（ds RNA）,而且DDX21主要通过其217-784氨基酸（aa）区域与RIG-I竞争性结合ds RNA,从而抑制IFN-β产生。上述结果表明DDX21通过与RIG-I竞争结合ds RNA抑制RLR介导的IFN-β产生。4.DDX10抑制PRRSV增殖的机制研究与DDX21不同,流式细胞术筛选结果表明DDX10具有抑制PRRSV增殖的能力。为了进一步验证其抗病毒效应,在MARC-145细胞、i PAM细胞（猪肺泡巨噬细胞系）上通过过表达或si RNA干扰的方式,结合IFA、Western blot和TCID50实验,证实过表达DDX10抑制PRRSV增殖,而干扰DDX10促进PRRSV增殖,表明DDX10抑制PRRSV增殖不依赖细胞类型。为了探讨DDX10抑制PRRSV增殖是否与调控IFN有关,在HEK-293T和i PAM细胞中分析了DDX10对IFN产生的影响,发现过表达DDX10促进转录因子IRF3和NF-κB活化以及IFN-β产生,干扰DDX10抑制Se V诱导的IRF3和NF-κB激活、IFN-β产生以及ISGs（ISG15、OAS1、Mx1、IFITM3）表达,表明DDX10可能通过拮抗IFN产生和信号转导抑制PRRSV增殖,而且这种抑制效应不依赖于DDX10的ATP酶活性和RNA解旋酶活性。同时,分析了PRRSV感染对DDX10表达与亚细胞定位的影响,发现PRRSV感染引起DDX10从细胞核向胞质迁移,并且降解DDX10。为了确定PRRSV降解DDX10的途径,用抑制凋亡途径（Z-VAD-FMK）、泛素蛋白酶体途径（MG132）、自噬溶酶体途径（CQ、NH4Cl）的特异性药物处理细胞,发现CQ或NH4Cl处理阻断PRRSV对DDX10的降解,提示PRRSV感染可能通过自噬溶酶体途径降解DDX10。进一步分析PRRSV编码蛋白与DDX10的相互作用及其对DDX10表达的影响,发现只有小囊膜蛋白（E蛋白）能够与DDX10互作,并呈剂量依赖性降解DDX10表达,而且单独表达E蛋白可上调自噬标志分子LC3-II的表达水平,NH4Cl处理以及敲除自噬关键基因ATG5/ATG7阻断E蛋白对DDX10的降解,表明E蛋白通过自噬溶酶体途径降解DDX10。核质分离实验也进一步证实E蛋白能够诱导DDX10从细胞核向胞质迁移,而自噬诱导剂Rapamycin处理显著减少胞质的DDX10,对细胞核的DDX10没有显著影响,表明E蛋白降解DDX10发生在胞质。通过Co-IP实验筛选与DDX10相互作用的自噬受体蛋白,发现只有p62与DDX10相互作用并促进E蛋白对DDX10的降解。进一步分析了敲除p62对DDX10表达的影响,发现E蛋白通过p62依赖的方式选择性自噬降解DDX10。上述研究结果表明,DDX10可通过激活IFN产生抑制PRRSV增殖,而PRRSV编码的E蛋白为了拮抗DDX10的抗病毒作用,诱导DDX10发生核质迁移,并通过自噬溶酶体途径降解DDX10,从而帮助PRRSV实现免疫逃逸。