表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测牛奶中抗生素残留的方法研究

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牛奶作为一种最理想的天然食品,其营养丰富,老少皆宜,但近年来出现的抗生素牛奶让消费者闻之色变。虽然抗生素在预防和治疗奶牛疾病方面疗效显著,但由于不规范的使用,会导致其残留而引起机体严重的不良反应,甚至死亡。因此,实现对其的高灵敏、高通量、快速简便的检测极为必要。本研究通过结合表面增强拉曼光谱(SERS)技术的高灵敏性和金标检测试纸(LFA)的便捷性,以在牛奶中残留危害较为严重的新霉素、林可霉素、喹诺酮类抗生素为检测对象,建立新型的SERS-LFA方法,实现对单个或多个抗生素的超灵敏检测。(1)通过在金纳米粒子的表面分别修饰4-氨基苯硫酚(PATP)和新霉素单克隆抗体(NEO mAb),合成了拉曼免疫探针NEO m Ab-AuNPs-PATP,构建了SERS-LFA方法。在最优条件基础上,得出在0.0001-10.0 ng/mL浓度范围内线性良好,新霉素的IC50为0.04 ng/mL,检出限为0.216 pg/mL。并与其他相似化合物无交叉反应性,显示出较高的特异性。对牛奶样品的加标回收率在90%-106%范围内,相对标准偏差在3%-5%范围内(n=3)。并且对信号的重现性进行测定,在五个不同浓度下,每个浓度随机测定10个点的相对标准偏差分别为3.8%,4.4%,2.9%,3.2%和5.1%。此外,与其他的检测新霉素的方法相比,SERS-LFA的灵敏度最高。(2)建立基于γFe2O3@Au磁金纳米花(γFe2O3@Au NFs)的SERS-LFA,对新霉素进行测定。对实验参数进行优化,测得在0.0001-1.0 ng/mL浓度范围内线性良好,新霉素的IC50为0.013 ng/mL,检出限为0.17 pg/mL。对牛奶样品的加标回收率在84%-109%之间,相对标准偏差在4%-6%之间(n=3)。并对重现性、特异性进行了评价。(3)分别制备两种拉曼免疫探针NEO mAb-AuNPs-PATP和NOR mAb-AuNPs-PATP,并组装带有两条检测线的试纸,对新霉素和诺氟沙星进行同时检测。通过对实验参数进行优化,测得在0.0001-1.0 ng/m L浓度范围内线性良好,新霉素的IC50为0.03 ng/mL,检出限为0.37 pg/mL,诺氟沙星的IC50为0.07 ng/mL,检出限为0.55 pg/mL。并对特异性进行评价,新霉素与其他类似物无交叉,而诺氟沙星与12种其他喹诺酮类有不同程度的交叉,交叉反应率在1.5%-135.14%之间。对牛奶样品的加标回收率在86%-121%之间,相对标准偏差在3%-6%之间(n=3)。与其他的检测喹诺酮类的方法相比,SERS-LFA的灵敏度最高。(4)采用高碘酸钠法制备林可霉素免疫抗原(LIN-BSA)和包被抗原(LIN-OVA),并成功筛选到林可霉素单克隆抗体,用间接竞争ELISA测定其IC50为0.69 ng/mL。基于单克隆抗体,分别制备NEO m Ab-Au NPs-PATP和LIN mAb-AuNPs-DTNB两种拉曼免疫探针,并组装带有一条混合检测线的试纸,对新霉素和林可霉素实现一步法同时检测。对实验参数进行优化,在0.0001-1.0 ng/mL浓度范围内线性良好,测得新霉素的IC50为0.038 ng/mL,检出限为0.33 pg/mL,林可霉素的IC50为0.024 ng/mL,检出限为0.29 pg/mL。对牛奶样品的加标回收率在84%-113%之间,相对标准偏差在3%-8%之间(n=3),并对其可行性、特异性进行了评价。此外,也与其他的检测林可霉素的方法进行了比较。
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