论文部分内容阅读
目的:研究脓毒症心功能障碍(sepsis-induced myocardial dysfunction,SIMD)自噬调控的关键信号通路及该信号通路中的关键基因,探讨调控关键基因对SIMD心肌细胞自噬水平变化的影响。方法:1、筛选脓毒症患者外周血基因表达量数据集(GSE65682、GSE131761、GSE134364)及SIMD小鼠心肌组织基因表达量数据集(GSE69345、GSE171546)。提取脓毒症患者数据集中自噬相关基因,对各数据集自噬相关基因表达量标准化处理,并进行基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA),筛选显著富集的自噬相关信号通路。对SIMD小鼠心肌组织基因表达量数据集进行GSEA分析,筛选与脓毒症患者相同的显著富集信号通路,并提取该信号通路中关键基因。利用GSE134364数据集中脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)人体脓毒症模型及小鼠SIMD动物模型基因表达量,研究关键基因与自噬效应标记物在各时间节点的变化趋势。2、以贵州医科大学附属医院内科重症监护病房确诊的SIMD患者为研究对象,同时以健康人群为对照组。采集SIMD患者外周血,利用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcription PCR,q RT-PCR)检测雷帕霉素不敏感的m TOR伴侣蛋白(rapamycin-insensitive companion of m TOR,Rictor)及自噬效应标记物微管关联蛋白3β(microtubule-associated protein 1 light chain 3β,LC3B)、Beclin-1的等基因的表达水平,对各基因表达量进行组内相关性分析,并与对照组进行组间比较分析。同时收集SIMD患者病例信息及相关检验结果,与各基因表达量进行相关性分析。3、取健康无特定病原体动物(specific pathogen free,SPF)级雄性昆明种小鼠36只,采用随机数字法分为假手术组、模型组、实验组,每组各12只。利用盲肠结扎穿孔术(cecum ligation and puncture,CLP)建立SIMD小鼠动物模型;实验组给予Rictor特异性抑制剂JR-AB2-011 10mg/kg腹腔注射,假手术组及模型组给予等量溶剂腹腔内注射。术后第12、24小时麻醉处死小鼠,透射电镜及苏木精-伊红(H-E)染色观察心肌组织病理结构变化;采集腹主动脉血,检测血清心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,c Tn I)及肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB,CKMB)水平;检测小鼠心肌组织中Rictor、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT)、LC3B等蛋白表达变化。结果:1、脓毒症患者各数据集间,共同自噬相关基因422个,显著富集在“BIOCARTA_MTOR_PATHWAY”信号通路中。SIMD小鼠心肌组织基因主要富集于“BIOCARTA MTOR PATHWAY”及“KEGG MTOR SIGNALING PATHWAY”信号通路中,m TOR信号通路是SIMD自噬调控的关键信号通路,Rictor为该信号通路的关键基因之一。GSE134364数据集中LPS建立的脓毒症人体模型,在LPS注射后第6小时,Rictor表达量较注射前显著上调(P<0.05);SIMD动物模型各时间节点Rictor基因表达较假手术组均显著升高(P<0.05)。2、研究共纳入37人,其中SIMD组25人,年龄55.16±20.95岁,其中男性14(56.0%)人,女性11(44.0%)人;对照组共纳入健康人12人,年龄43.33±8.78岁,其中男性6(50.0%)人,女性6(50.0%)人。SIMD组Rictor表达水平较对照组显著升高(P<0.05),AKT、LC3B、Beclin-1较对照组显著降低(P<0.05)。SIMD组Rictor相对表达量与AKT2(P<0.05,r=-0.76)、Beclin-1(P<0.05,r=-0.65)及LC3B(P<0.05,r=-0.67)呈负相关关系,并与PCT呈正相关关系(P<0.05,r=0.67);SIMD组LC3B相对表达量与APACHE II评分呈负相关关系(P<0.05,r=-0.77)。3、小鼠心肌H-E染色:假手术组心肌组织排列正常;模型组可见心肌纤维中度水样变性;实验组可见心肌纤维轻度水样变性。小鼠心肌透射电镜:假手术组无肌纤维断裂,肌纤维排列紧密;模型组肌纤维碎裂、片段化,排列稀疏、变窄,大量断裂,胞质严重水肿,胞内可见1个自噬溶酶体;实验组肌纤维排列相对紧密,较多处肌纤维断裂,轻度水肿,视野下可见1个自噬小体及4个自噬溶酶体。小鼠SIMD模型组各时间节点cTnI、CK-MB及Rictor、Phospho-AKTser473、LC3B等蛋白表达量均高于假手术组(P<0.05);实验组各时间节点c Tn I、CK-MB及Rictor、Phospho-AKTser473等蛋白表达量均低于模型组,LC3B蛋白表达量高于模型组(P<0.05)。结论:1、SIMD患者及小鼠SIMD模型的自噬水平显著下降,心肌损伤标记物升高,SIMD患者低水平的自噬与心肌细胞损伤显著相关;2、m TOR信号通路是调控SIMD心肌细胞自噬水平变化的主要信号通路,其在早期即被激活,抑制心肌的自噬水平,导致心肌细胞损伤;3、Rictor是m TOR信号通路调控心肌细胞自噬的关键靶点,可通过靶向抑制Rictor的表达水平,降低m TOR信号通路的激活,增加心肌细胞自噬并减轻心肌细胞的损伤,改善因脓毒症导致的心功能障碍。