睾丸组织冷冻保存作为雄性遗传资源多样性保护的重要策略之一,为生殖细胞保存、珍稀濒危物种保护及未成年雄性辅助生殖提供了新的途径。目前,啮齿类睾丸组织冻存体系及体外生精的研究已取得显著进展,但牛等大家畜的相关研究仍处于探索阶段。由于睾丸组织结构复杂,各类细胞的大小、低温耐受能力、膜渗透压等均存在差异,冻存-复苏过程中睾丸组织和细胞的生理活性一般会显著降低。因此,现有的睾丸组织冻存体系仍需完善,特别是在牛等大家畜方面。基于前期基础,本研究探索了海藻糖对牛睾丸组织冻存的适宜浓度,优化了冷冻体系及精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）培养体系,进而应用于冻存复苏后睾丸组织的体外培养、移植及透射电镜样品制备,通过电镜观察、免疫组化染色和细胞培养,鉴定分析了新型间质细胞——特络细胞（Telocytes,TCs）的形态特征、定位分布及生物学特性,评估了复苏后组织的活性及生精上皮发育能力。冻存体系优化结果显示,冻存液（freezing medium,FM）中添加不同浓度的海藻糖对牛睾丸组织长期低温保存（6个月）具有显著影响。采用含10%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）、10%血清替代物（Knockout serum replacement,KSR）和20%海藻糖的FM5,结合非程控慢速冷冻（uncontrolled slow freezing,USF）程序,对牛睾丸组织冻存的效果较好。与其它浓度海藻糖添加组（FM1-FM4,FM6）+USF体系相比,FM5组睾丸组织复苏后结构完整、生精细胞排列规则、细胞凋亡率低且存活率高,利于UCHL1（SSCs标记）阳性SSCs的保存。因此,后续实验均采用FM5组冻存的组织。在此基础上,分离获得成年牛生精上皮细胞悬液,差速贴壁以富集SSCs,探讨了牛SSCs在自体睾丸细胞和小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast,MEF）饲养层共培养体系中的差异。荧光定量PCR分析显示,自体睾丸细胞共培养体系可维持其多能性基因（Sox2,Pou5f1）、SSCs标记基因（Gfrα-1,Uchl1）的高水平表达,产生较多SSCs克隆。这表明该体系更有利于牛SSCs体外培养。在复苏后睾丸组织培养方面,以琼脂凝胶为支撑,通过凝胶底部吸收培养液中营养物质,将待培养组织置于气液界面上,维持和促进未成熟睾丸组织发育的方法已在啮齿类和人的研究中取得进展。基于前人的研究,本实验比较了复苏后犊牛睾丸组织在有、无琼脂凝胶培养条件下体外发育的差异。培养18、27 d后分析显示,与贴壁培养相比,琼脂凝胶培养法有利于维持睾丸组织结构和生精上皮的发育,可显著降低细胞凋亡,上调睾丸组织中SSCs标记（Gfrα-1,Uchl1）、减数分裂标记（Sycp3）、成熟精子标记（Crisp1）及体细胞标记（Star,Sox9,Acta2）基因的表达,促进生精细胞的增殖、分化和发育。我们还观察到,贴壁培养组织的周围迁移出大量有狭窄-膨大节段交替形成的念珠样长突起的TCs样细胞,此类细胞表达特异性标记分子CD34、VIM、PDGFRα,具有TCs的典型特征。因冻存-复苏组织的细胞活性与其良好的微细结构保持有密切关系,为检验复苏后牛睾丸组织微细结构的完整性,本研究制备了透射电镜样品以观察超微结构,进而探明上述TCs在牛睾丸组织中的定位分布及形态学特征。结果显示:成年牛和犊牛睾丸组织超微结构完好,TCs均位于曲细精管基膜和管周肌样细胞（peritubular myoid cell,PMC）外侧,胞体较小,呈椭圆形或三角形,有2-3条细长的节结状突起（telopodes,Tps）,可与同类细胞或其他类型细胞相互连接,在间质内形成复杂的3D网络;其核内异染色质多,核外胞质少,内有线粒体等细胞器。睾丸组织切片免疫组化染色结果与上述超微结构观察一致,成年牛及犊牛的TCs特异性标记分子CD34主要分布在曲细精管基膜外侧。表明TCs主要位于间质中,这为进一步了解牛睾丸生理结构奠定了基础。为进一步评估冻存-复苏后犊牛睾丸组织的活性及其生精上皮的发育分化能力,本研究还将其进行了小鼠背部皮下异种移植实验。结果显示,牛睾丸组织移植28天后,保留了曲细精管样结构;生精细胞在相关基因水平启动分化机制,与正常30日龄的牛睾丸发育状态基本保持一致。这表明移植的组织确有活性,其生精上皮和间质组织有一定的发育分化能力。综上,本研究筛选建立了添加20%海藻糖的牛睾丸组织冻存优化体系FM5+USF,确证自体睾丸细胞共培养体系对牛SSCs短期培养更为适宜,琼脂凝胶法有利于睾丸组织培养,冻存-复苏的组织移植后可存活发育,证实睾丸冷冻技术联合组织培养及移植技术应用的可行性,同时也明确了TCs在牛睾丸中的存在和分布特征,为进一步了解大型经济动物的睾丸生理结构,保存雄性种质资源提供参考。