中华紫胶虫紫胶合成关键基因筛选及功能验证

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紫胶虫是一种具有重要经济价值的资源昆虫,其雌虫通过腺体分泌出紫胶,是一种纯天然生物树脂,因具有粘接性强、绝缘性好等优良性状,被广泛应用于军工、医药、化工等行业。因其具有重要的经济价值,从分子水平上弄清紫胶合成的机制,对于提高紫胶虫的泌胶量,建立持续高效的紫胶生产系统具有重要意义。本文以中华紫胶虫(Kerria chinensis)为研究对象,通过收集不同时期的紫胶虫,测定其个体泌胶量和泌胶速率,揭示中华紫胶虫泌胶特性及动态规律;分析不同时期中华紫胶虫的转录组数据,通过紫胶合成信号通路关键基因解析和差异基因表达分析,筛选出与泌胶密切相关的候选基因;采用基因沉默(RNAi)技术对紫胶合成主效基因进行功能验证。主要研究结果如下:1.中华紫胶虫泌胶动态规律通过对中华紫胶虫不同时期雌虫个体泌胶量和泌胶速率的测定,研究结果表明,中华紫胶虫幼虫期泌胶量较少,成虫期大量泌胶,在成虫中-后期个体泌胶速率最大,可达到4.82×10-1±0.0005 mg/d,在整个生命周期中的个体泌胶量在24.9±0.0037 mg左右。2.中华紫胶虫不同时期转录组分析根据中华紫胶虫泌胶动态规律,选择幼虫期(L)、成虫初期(A1)、成虫中-后期(A2)3时期的样品进行转录组测序分析,共获得205 581个转录本(transcript),其中有183 899个unigene得到注释。差异基因表达分析结果显示,在3个时期共获得6 435个差异基因,对其进一步分析发现,大量泌胶的成虫期与少泌胶的幼虫期相比,有202个基因上调,1 187个基因下调。通过基因表达水平与紫胶泌胶速率以及基因推测功能之间的相关性,初步筛选了可能参与紫胶合成的28个候选基因,包括参与脂肪酸合成的19个基因;参与萜类化合物生物合成的4个基因和参与UDP驱动糖基化的5个基因。3.利用RNAi技术对FAD基因进行功能验证构建了含有中华紫胶虫FAD基因的重组载体FAD-L4440,并转入到HT115感受态细胞中,扩大培养至菌液OD600为0.4,以IPTG为诱导剂表达靶基因相对应的dsRNA,得到FAD-L4440-HT115菌体。采用虫体涂抹法将dsRNA转染到中华紫胶虫体内。研究结果表明,干扰后FAD基因表达量明显降低,其中低浓度(6.2 ng/ml)在12 h和中浓度在24 h时相对于L4440-HT115菌液对照组有显著差异,分别降低了90.90%和86.52%,不同处理组的个体泌胶量相比ck组有所差异,其中低浓度处理对紫胶虫个体泌胶量有明显影响。表明FAD基因对紫胶虫泌胶有调控作用。本研究对中华紫胶虫进行转录组测序,筛选出28个与紫胶合成密切相关的主效基因,为后续解析紫胶合成的分子机理积累了基因数据。构建了中华紫胶虫RNA干扰载体,在基因功能验证中引入了细菌表达dsRNA的RNAi系统,使用虫体涂抹法将其导入昆虫体内,为RNAi转染过程中不适用注射、喂食等转染方法的昆虫提供技术参考。
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