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目的 探讨长链非编码RNA POU6F2-AS2敲除或过表达联合X射线对人食管鳞状细胞癌细胞生长、细胞凋亡、DNA损伤修复、放射敏感性的影响及机制如何,进一步构建人食管鳞状细胞癌的裸鼠移植瘤模型（POU6F2-AS2稳定敲除）,在体内验证POU6F2-AS2稳定敲除致移植瘤模型放射增敏的作用。方法（一）体外实验:1、Real-time PCR法检测POU6F2-AS2在OSCC细胞系和OAC细胞系中的表达情况;2、阳离子脂质体和重组慢病毒法对OSCC细胞株分别进行瞬时转染和稳定转染,稳转48小时再用嘌呤霉素和杀稻瘟菌素筛选稳定敲除和稳定过表达的细胞后,用RT-PCR法验证;3、MTT法检测POU6F2-AS2敲除联合X射线对细胞增殖的影响;4、克隆形成法检测POU6F2-AS2敲除或过表达对细胞的放射敏感性的影响;5、流式细胞术测定POU6F2-AS2敲除或过表达对细胞凋亡的影响;6、彗星实验、胞质分裂阻滞微核实验和免疫荧光实验检测POU6F2-AS2敲除对细胞DNA损伤修复能力的影响;7、RNA-pulldown、质谱分析、Westem-blot、RIP和克隆形成实验鉴定并验证与POU6F2-AS2发挥协同作用的染色体结合蛋白及绑定区域;8、免疫荧光共染色、ChIP-Seq和qPCR检测POU6F2-AS2是否影响与其发挥协同作用的蛋白在染色体上的绑定和功能。（二）体内试验:建立25只裸鼠皮下人食管鳞状细胞癌移植瘤模型,将移植瘤模型裸鼠随机分为Control组、shCon组、shPOU6F2-AS2稳定敲除组、照射组、照射+shPOU6F2-AS2稳定敲除组。测量每组移植瘤模型裸鼠的体重和肿瘤体积并绘制体重变化曲线和肿瘤生长曲线,同时计算各组的肿瘤生长抑制率。结果（一）体外实验结果:1.1、我们首先做了基于Genevestigator平台的meta分析,发现POU6F2-AS2是唯一的非编码基因且没有在OAC或正常食管组织中高表达。1.2、Real-time PCR结果显示:在选择的6种OSCC细胞系和2种OAC细胞系中,POU6F2-AS2在OSCC细胞系中高表达,在OAC细胞系中低表达。我们选择两种POU6F2-AS2高表达的OSCC细胞系（KYSE140和KYSE510）和两种相对POU6F2-AS2低表达的OSCC细胞系（KYSE30和KYSE70）做后续研究;2、RT-PCR验证POU6F2-AS2在OSCC细胞中能够成功被敲除和过表达;3.1、在无X射线照射下,POU6F2-AS2敲除没有影响OSCC细胞生长。3.2、在联合X射线照射下,POU6F2-AS2敲除组细胞存活率与对照组比较显著下降（P<0.01）;4、POU6F2-AS2低表达组细胞克隆形成实验表现出辐射增敏（P<0.01）。POU6F2-AS2过表达组细胞克隆形成实验表现出辐射抵抗（P<0.01）;5、POU6F2-AS2敲除联合X射线可显著增加人食管鳞状细胞癌细胞的凋亡作用（P<0.01）;6.1、在各时间点直至24h,POU6F2-AS2敲除组表现出延长的DNA尾（P<0.05）。6.2、POU6F2-AS2敲除组的细胞微核率及微核细胞率显著增高（P<0.05）6.3、POU6F2-AS2 敲除细胞的 yH2AX foci 点阳性细胞增加（P<0 05）;7.1、RNA pulldown实验中与被标记的POU6F2-AS2义关联的蛋白被洗脱下来并送去做质谱分析,结果显示是Ybx1蛋白参与POU6F2-AS2的功能。7.2、Western Blot验证结果表明POU6F2-AS2义RNA结合Ybx1蛋白,而反义和lacZ无义对照RNAs不结合该蛋白。反之亦然,我们免疫沉淀内源性Ybx1蛋白并分析绑定的RNAs,real-time PCR结果发现大量的POU6F2-AS2。7.3、在克隆形成实验中,我们提高POU6F2-AS2敲除细胞中Ybx1蛋白的表达。POU6F2-AS2低表达细胞克隆形成实验表现出辐射增敏的同时,Ybx1过表达部分地拯救了细胞的克隆抑制。相反地,尽管POU6F2-AS2过表达细胞对辐射抵抗,降低Ybx1表达部分地反转辐射抵抗。7.4、catRAPID程序预测POU6F2-AS2的哪个区域可与Ybx1蛋白绑定,然后合成POU6F2-AS2 的一系列截断序列进行 pulldown,western blot 结果表明 POU6F2-AS2 N端1-800个核苷酸区是主要的绑定区;8.1、免疫荧光共沉淀结果发现POU6F2-AS2敲除取消了激光微束辐射后Ybx1向DNA损伤点定位。8.2、染色质免疫共沉淀测序技术（ChIP-Seq）发现POU6F2-AS2减弱Ybx1在染色质上的信号。ChIP-qPCR结果表明POU6F2-AS2敲除后,Ybx1向其靶基因CCNB1和P53启动子区域募集下降。此外还分析了 POU6F2-AS2敲除后的基因表达谱,发现33个与Ybx1绑定区重叠的基因启动子。同时,CCNB1基因的表达下降。（二）体内实验结果:1、成功构建的各组人食管鳞状细胞癌移植瘤裸鼠到终结实验而被处死前,裸鼠的体重无明显变化（P>0.05）;2、照射+shPOU6F2-AS2稳定敲除组的人食管鳞状细胞癌裸鼠移植瘤的体积与其它三组相比显著减小,差异具有统计学意义（P<0.05）,shPOU6F2-AS2稳定敲除组、照射组、照射+shPOU6F2-AS2稳定敲除组的肿瘤生长抑制率分别为:18.66±4.94%、38.24±6.51%、65.38±7.47%。结论（1）我们报道一种未鉴定的lncRNA POU6F2-AS2,其在OSCC中高表达;（2）POU6F2-AS2单独敲除没有影响OSCC细胞生长。但在联合X射线照射下,POU6F2-AS2敲除组细胞存活率显著下降;（3）POU6F2-AS2敲除能明显增加OSCC细胞的放射敏感性,POU6F2-AS2过表达能明显增加OSCC细胞的辐射抗性;（4）POU6F2-AS2敲除可显著加强X线诱导的OSCC细胞的凋亡作用;（5）POU6F2-AS2敲除联合X射线照射能显著加重OSCC细胞的DNA损伤;（6）POU6F2-AS2与Ybx1（一种DNA损伤修复蛋白）联合作用,POU6F2-AS2 N端1-800个核苷酸区是主要的绑定区,Ybx1能补偿或者反转POU6F2-AS2对OSCC细胞辐射敏感性和损伤应答中的作用,POU6F2-AS2能影响Ybx1的染色体定位,进而调控Ybx1靶基因的表达水平;（7）POU6F2-AS2敲除联合X射线可对人食管鳞状细胞癌裸鼠移植瘤的生长呈现显著的抑制作用,而对裸鼠的体重无明显影响。