选择蛋白(Selectin)是一类和白细胞运行密切相关的 C 类动物凝集素家族,包括 E-、P-、L-选择蛋白三个成员,它们是分别存在于激活的血管内皮细胞表面、血小板和白细胞表面的黏附分子,其表达有严格的细胞特异性。其中,L-选择蛋白(L-selectin)在大部分白细胞表面持续表达,是淋巴细胞“归巢”的受体。 L-选择蛋白的基因位于一号染色体长臂上,不同种系间有高度同源性。L-选择蛋白为Ⅰ型跨膜糖蛋白,由 324 个氨基酸组成,分子量为 74-95kDa。L-选择蛋白分子从 N-末端到 C-末端由五部分组成,分别是:钙离子依赖性凝集素样区(lectin),又称糖识别域(carbohydraterecognition, CRD)、表皮生长因子样结构区(epidermal growth factor like,EGF-like)、2 个较短的共同重复序列(short concensus repeat, SCR),又称补体调节蛋白结构域、最后是跨膜区和短的胞质内尾巴。其中凝集素样结构域和表皮生长因子样结构域与其生物学功能密切相关。L-选择蛋白不仅在血液系统发挥重要作用,如:淋巴细胞的“归巢”,炎症反应中炎症细胞的聚集和渗出等,而且在人类胚泡着床过程中,L-选择蛋白也发挥了重要作用。Olga D.Genbacev 等人新近研究表明: L-选择蛋白介导了胚泡的着床过程。 肿瘤的淋巴道转移与淋巴细胞“归巢”现象有相似之处,因此 L-选择蛋白与肿瘤淋巴道转移的关系日益受到关注。以往研究发现:在 T2细胞杂交瘤中,那些专一性向外周淋巴结转移的肿瘤细胞表面均有强的 L-选择蛋白表达;在非何杰金淋巴瘤中,肿瘤细胞向淋巴结的扩散被认为是肿瘤细胞扩散的重要环节,转移到淋巴结中定植的非何杰金淋巴瘤表面经常有 L-选择蛋白的表达,而那些优先在周围组织中定植的淋巴瘤则几乎没有 L-选择蛋白表达,Fawn Qian 等人用致癌的转基因鼠模型证实了 L-选择蛋白可协助肿瘤细胞经淋巴结转移,以上现象说明 L-选择蛋白与肿瘤淋巴道转移有关。我们实验室前期工作表明,小鼠肝癌细胞高低转移株 Hca-F 和 HCa-P 的淋巴道转移潜能与其表达的 L-选择蛋白存在正相关。对 L-选择蛋白与肿瘤淋巴道转移相关性的研究,不论从理论上还是临床应用上都具有一定的意义,因此,有必要深入探讨 L-选择蛋白在肿瘤淋巴道转移过程中的作用机制。目的:本实验利用小鼠 L- selectin 胞外功能区与人 IgG-Fc 段构建的嵌合蛋白表达载体在 COS-7 细胞中表达具有生物活性的嵌合蛋白,观察其对 P388d1 细胞与淋巴结黏附能力的影响,为深入探讨 L-选择蛋白介导肿瘤细胞淋巴道转移的作用机制和抗肿瘤细胞淋巴道转移的临床应用奠定基础。方法:将 L-selectin/IgG 嵌合蛋白的表达载体,通过氯化钙法转化到E.coliHB10/P3 中。培养细菌,提取超纯去内毒素质粒,经 PCR 鉴定后,用脂质体转染试剂将其转染至 COS-7 细胞中。继续培养转染后的COS-7 细胞,回收细胞培养上清,通过 ELISA 法鉴定目的蛋白的表达情况并对转染条件进行优化。在此基础上进行大量转染,回收细胞培养上清,利用 ProteinA 亲和层析柱对培养上清中的嵌合蛋白进行纯化,用 SDS-PAGE、Dot-blot 、Western-blot 分析鉴定目的蛋白;进而通过体外黏附实验观察其对 P388d1 细胞与淋巴结黏附能力的影响。结果:1%琼脂糖电泳结果显示所提质粒主要为超螺旋结构,PCR结果显示500bp处有一特异条带,与预期片段大小一致。重组L-selectin/ IgG 表达载体转染COS-7细胞后的48 小时细胞培养上清中能检测到目的蛋白