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本文主要从以下几个部分展开论述: 第一部分 草莓中诺如病毒不同洗脱和富集方法的评估 目的: 通过对诺如病毒的洗脱、浓缩富集方法进行优化,评估一种快速和敏感富集草莓中诺如病毒的方法,完善我国食源性诺如病毒检测体系,为食源性诺如病毒的防控提供支持。 方法: 以鼠诺如病毒(Murine Norovirus-1,MNV-1)为模式病毒,考察Tralk洗脱液、TGBE(Tris-hcl glycine beef extract buffer)洗脱液和NaOH洗脱液对MNV-1的洗脱效果,检测5%、10%和15%PEG6000/0.3M NaCl对MNV-1的富集效果,观察超滤浓缩对诺如病毒的富集效果。 结果: 1.TGBE缓冲液洗脱效果优于Tralk洗脱液和NaOH洗脱液。 2.10%PEG6000/0.3M NaCl与15%PEG6000/0.3M NaCl对MNV-1的富集效果相同,且二者的富集效果均优于5%PEG6000/0.3M NaCl。 3.该优化方法富集检测草莓样本中的诺如病毒,回收率最高可达44.04%。 4.超滤浓缩后,诺如病毒的检测限达到102基因拷贝数/10g草莓。 结论: TGBE碱性缓冲液更适合于成分较复杂的草莓样品的病毒洗脱。10%PEG6000/0.3M NaCl更适合病毒的沉淀浓缩。PEG6000沉淀结合超滤浓缩病毒能够达到较好的富集效果。 第二部分 受体捕获诺如病毒检测方法的建立和应用 目的: 评价新型感染性诺如病毒检测方法原位捕获反转录实时定量PCR(In situ capture realtime quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,ISC-RT-qPCR)的特异性,并将其应用于新鲜草莓中诺如病毒的检测。为我国食源性病毒病的应对提供可借鉴的标准化实验室检测技术。 方法: 选取诺如病毒GⅡ组不同基因型和不同浓度的临床粪便标本,观察ISC-RT-qPCR方法的特异性。采用ISC-RT-qPCR方法对以GⅡ组诺如病毒人工污染新鲜草莓样本进行检测。 结果: 1.ISC-RT-qPCR可特异性检测所有GⅡ组诺如病毒8种基因型临床腹泻样本。 2.与传统RT-qPCR相比,ISC-RT-qPCR检测的Ct值并未随着诺如病毒浓度的降低而升高。 3.人工污染新鲜草莓的ISC-RT-qPCR检测限为1.36基因拷贝数/10g草莓。 结论: PGM与暴发流行的GⅡ群诺如病毒均有较好的结合能力,基于免疫捕获的ISC-RT-qPCR这一方法可用于草莓基质中诺如病毒的富集检测。