研究背景:类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种常见多发的自身免疫性疾病,其主要病理特征以慢性关节炎症为主,有滑膜细胞增生,血管翳形成,炎性细胞浸润并侵犯周围滑膜组织等,起病反复,给患者带来很大痛苦,对社会和家庭也是巨大的负担。RA的发病机制还不完全清楚,已有研究表明:炎性细胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α在病变部位的持续作用对RA的维持和发展起重要作用,而炎性细胞因子的释放是受核转录因子NF-κB控制,NF-κB作为一种重要的核转录因子在RA发病中的作用主要有两个途径:一是核转录因子κB活化后可增强炎性介质的转录水平,同时这些炎症介质又可以反过来激活NF-κB的表达,两者构成正反馈机制导致类风湿关节炎炎症反应的进行。二是可以阻断滑膜细胞的凋亡,导致滑膜细胞增生。核转录因子κB能够调节细胞凋亡抑制蛋白的表达,对肿瘤坏死因子诱导的类风湿关节炎成纤维细胞的凋亡有拮抗作用。因此,核转录因子κB是治疗RA具有吸引力的靶点。　　 穿山龙水溶性总皂苷(water-solubility nipponica saponin)是薯蓣科植物穿山龙薯蓣(Rhizoma dioscreae,RDN)的干燥根茎穿山龙的有效治疗成分,具有免疫抑制作用。本课题组前期工作表明,穿山龙总皂苷对RA动物模型有较好的治疗作用。　　 目的:本研究以大鼠成纤维样滑膜细胞株RSC-364为对象,用IL-17、TNF-α诱导制备RA的细胞模型,通过检测细胞中的NF-κBp65蛋白、IκB-α蛋白和NF-κBp65 mRNA、IκB-αmRNA的表达,探讨穿山龙水溶性总皂苷对RA的治疗作用及机制,为临床应用穿山龙治疗RA提供实验依据。　　 方法:　　 1.培养大鼠成纤维样滑膜细胞株RSC-364,应用IL-17、TNF-α作为刺激物诱导RA细胞模型。　　 取对数生长期的RSC-364细胞(2×104/ml）,每孔1000μl加入六孔板培养24h,分别在孔中加入白介素-17(10μg/L)+肿瘤坏死因子-α(10μg/L),于37℃、CO2培养箱培养24小时,制备细胞模型。　　 2.将10mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L穿山龙水溶性总皂苷溶液,作用于RSC-364细胞,孵育12h、24h、36h、48h后加MTT,4h后加DMSO,应用全自动酶联仪测定细胞的OD值(光密度),通过OD值反应细胞的存活率,比较不同浓度的穿山龙水溶性总皂苷作用不同时间对RSC-364细胞存活率的影响,以筛选出最佳药物浓度和作用时间。　　 3.大鼠成纤维样滑膜细胞株RSC-364接种于六孔板,不同药物组分为4组:正常组、模型组、雷公藤甲素组、穿山龙水溶性总皂苷组。穿山龙水溶性总皂苷不同浓度组分为正常组、模型组、穿山龙水溶性总皂苷10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L组。　　 取对数生长期的RSC-364细胞(2×104/ml),每孔1000μl加入六孔板培养24h,药物组分别加入雷公藤甲素、穿山龙水溶性总皂苷培养1h后加入TNF-α(10μg/L)+IL-17(10μg/L),模型组直接加入刺激物,正常组不作处理。将细胞置于37℃、CO2培养箱培养24小时,测定NF-κBp65和IκB-α表达情况。同样培育方法检测穿山龙水溶性总皂苷不同浓度组。　　 4.分别提取各组细胞蛋白,进行蛋白定量计算上样体积,采用western blot的方法检测各组NF-κBp65蛋白和IκB-α蛋白的表达。　　 5.提取各组细胞mRNA,逆转录cDNA,应用RT-PCR技术检测各组NF-κBp65 mRNA和IκB-αmRNA的表达。　　 6应用SPSS11.5软件进行统计学分析,判断结果是否有统计学差异(P＜0.05),结果用平均数±标准差(-x±S)表示,组间差异用单因素方差分析,两两比较用q检验,以α=0.05作为检验标准。　　 结果:　　 1.不同浓度穿山龙水溶性总皂苷对细胞存活率的影响。　　 分别将浓度为10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L的穿山龙水溶性总皂苷作用于RSC-364细胞,用MTT法检测细胞存活率,各浓度组作用于细胞12h、24h时,细胞存活率较高,作用36h和48h时,所有浓度组细胞存活率均明显降低,较对照组差别有统计学意义(P＜0.05)。药物作用于细胞24小时时10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L浓度组OD值同对照组比较差别无统计学意义(P＞0.05)无明显的细胞毒性.40 mg/L、50 mg/L浓度使细胞存活率明显下降,表现出明显细胞毒性,OD值同对照组比较有统计学差异(P＜0.05)。　　 2.穿山龙水溶性总皂苷对细胞NF-κBp65蛋白表达的影响　　 用Western blot方法检测各组NF-κBp65蛋白的表达。结果显示:正常组最低,模型组NF-κBp65蛋白表达量最高,而雷公藤甲素组、穿山龙水溶性总皂苷组NF-κBp65蛋白表达较模型组显著降低(P＜0.05),两药物组之间差别无统计学意义(P＞0.05)。穿山龙水溶性总皂苷三个不同浓度组均对NF-κB表达呈现抑制作用,不同浓度间差别有统计学意义(P＜0.05)。　　 3.穿山龙水溶性总皂苷对细胞IκB-α蛋白表达的影响　　 用Western blot方法检测各组IκB-α蛋白的表达。各组相比较:正常组最高,模型组IκB-α蛋白表达量最低,而雷公藤甲素组、穿山龙水溶性总皂苷组相较于模型组IκB-α蛋白表达明显升高(P＜0.05),两药物组之间无显著性差异(P＞0.05)。穿山龙水溶性总皂苷三个不同浓度组均提升IκB-α蛋白表达量并呈现剂量依赖性(P＜0.05)。　　 4.穿山龙水溶性总皂苷对细胞NF-κBp65 mRNA表达的影响　　 用RT-PCR技术检测各组NF-κBp65 mRNA的表达。正常组最低,模型组最高,与模型组相比,雷公藤甲素组、穿山龙水溶性总皂苷组NF-κBp65 mRNA表达显著降低,差别有统计学意义(P＜0.05),两药物组之间差别无统计学意义(P＞0.05)。同模型组相比,穿山龙水溶性总皂苷三个不同浓度组均对NF-κBp65 mRNA表达呈现浓度依赖性抑制作用(P＜0.05)。　　 5穿山龙水溶性总皂苷对细胞IκB-αmRNA表达的影响　　 用RT-PCR技术检测各组IκB-αmRNA的表达。结果显示:正常组最高,模型组IκB-αmRNA表达量最低,雷公藤甲素组、穿山龙水溶性总皂苷组IκB-αmRNA表达较模型组显著升高,差别有统计学意义(P＜0.05),两药物组之间差别无统计学意义(P＜0.05)。穿山龙水溶性总皂苷三个不同浓度组均提升IκB-αmRNA表达并呈现剂量依赖性(P＜0.05)。　　 结论:　　 1.不同浓度的穿山龙水溶性总皂苷对RSC-364细胞存活率有不同影响:30mg/L浓度及其以下浓度对细胞无明显毒性作用,而40mg/L浓度及其以上对细胞具有明显毒性。　　 2.RSC-364细胞模型中,模型组细胞NF-κBp65 mRNA和蛋白表达较正常组均显著增高,IκB-α则出现相反趋势。　　 3.穿山龙水溶性总皂苷可以下调NF-κBp65 mRNA和NF-κBp65蛋白表达水平,并提升IκB-αmRNA以及和IκB-α蛋白的表达。　　 4.随着穿山龙水溶性总皂苷浓度的增加,其抑制NF-κB活化的能力也逐渐增强,呈现一定的剂量依赖效应。