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研究背景：胃癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,是肿瘤死亡的第三大常见原因。虽然胃癌的发病率与死亡率一直是逐年降低的,但其仍然是世界范围内一个重要的公共卫生问题。我们前期研究证实SIRT1在胃癌中的表达是下调的,它通过抑制细胞周期蛋白cyclinD1诱导G1期停滞,从而抑制胃癌的发生发展。然而,引起SIRT1下调潜在的上游调控机制仍然未知。研究目的：探究miR-543通过调控SIRT1的表达促进胃癌发生发展的分子机制,为胃癌的治疗提供新的靶点。研究结果：1.我们利用三种不同的生物信息学软件TargetScan、PicTar和miRanda,初步筛选出了8种可能靶向调控SIRT1的候选miRNAs,分别是miR-92a-3p、miR-128、 miR-132-3p、miR-135、miR-138、miR-181、miR-199a-5p和miR-543,其中miR-543与SIRT1 mRNA3’-UTR区有两个不同的结合位点,在胃癌细胞系BGC-823中转染候选miRNAs的mimics通过Western blotting实验方法发现miR-543可以使BGC-823细胞中SIRT1的蛋白表达水平显著降低,其他的几个miRNA对SIRT1的表达均无明显影响。2.在分子水平上,候选miRNA的mimics和inhibitor分别转染人胃粘膜上皮永生细胞系GES-1和胃癌细胞系AGS、BGC-823,通过qRT-PCR、Western blotting和双荧光素酶活性实验方法分别证实候选miRNA对SIRT1的表达调控作用。结果发现：在BGC-823和GES-1细胞中miR-543使SIRT1的mRNA和蛋白表达水平均明显下调,而在AGS细胞中虽然miR-543使SIRT1的mRNA表达水平没有明显变化,但是SIRT1的蛋白表达水平也是明显下调的。在BGC-823细胞中分别共同转染miR-543 mimics/inhibitor和SIRT1mRNA3’-UTR野生型载体WT、SIRT1mRNA3’-UTR突变载体Mut-1(第一个位点发生突变)、SIRT1mRNA3’-UTR突变载体Mut-2(第二个位点发生突变)、SIRT1mRNA3’-UTR突变载体Mut-bo(两个位点同时发生突变),结果发现：转染miR-543 mimics后,SIRT1 WT质粒使细胞荧光素酶活性降低,SIRT1Mut-1质粒、SIRT1 Mut-2质粒使细胞的荧光素酶活性都有一定程度的恢复,而SIRT1 Mut-bo质粒使细胞的荧光素酶活性得到完全恢复。相反,转染miR-543 inhibitor后,SIRT1 WT质粒使细胞荧光素酶活性增加,SIRT1Mut-1质粒、SIRT1 Mut-2质粒使细胞的荧光素酶活性都有一定程度的恢复,而SIRT1 Mut-bo质粒使细胞的荧光素酶活性得到完全恢复。3.在细胞水平上,通过MTS实验方法检测候选miRNA对细胞增殖能力的影响。MTS实验表明,在人胃粘膜上皮永生细胞系GES-1和胃癌细胞系AGS、BGC-823中转染miR-543的mimics后,AGS,BGC-823和GES-1细胞的增殖能力明显增加。相反,转入miR-543的inhibitor后,AGS、BGC-823和GES-1细胞的增殖能力受到显著抑制。在BGC-823细胞中共同转染miR-543mimics和SIRT1表达载体,SIRT1的表达逆转了miR-543促进细胞增殖的能力。4.在细胞水平上,通过克隆形成实验检测候选miRNA对细胞克隆形成能力的影响。克隆形成实验表明,在人胃粘膜上皮永生细胞系GES-1和胃癌细胞系AGS、BGC-823中转染miR-543的mimics后,AGS, BGC-823和GES-1细胞的克隆形成能力明显增加。相反,转入miR-543的inhibitor后,AGS、BGC-823和GES-1细胞的克隆形成能力受到显著抑制。在BGC-823细胞中共同转染miR-543 mimics和SIRT1表达载体,SIRT1的表达逆转了miR-543促进细胞的克隆形成能力。5.在细胞水平上,用流式细胞术分别检测候选miRNA对细胞周期进程的影响,并通过Western blotting检测SIRT1下游分子细胞周期蛋白的表达情况。结果发现：在人胃癌细胞AGS和BGC-823中转染miR-543的mimics后,细胞更多的进入到了G2期,并且使细胞周期蛋白cyclinD1的表达明显增加。相反,转染miR-543的inhibitor后更多的细胞停滞在了G1期,细胞周期蛋白cyclinD1的表达也受到显著抑制。在BGC-823细胞中共同转染miR-543mimics和SIRT1表达载体后,SIRT1的表达逆转了miR-543促进细胞周期进程的作用,并且恢复了细胞周期蛋白cyclinD1的表达。6.在组织水平上,我们通过qRT-PCR方法检测在胃癌组织及癌旁组织标本中候选miRNA与SIRT1的表达水平,并分析候选miRNA与SIRT1表达水平的相关性,以及候选miRNA表达与病人临床病理学特征之间的关系。结果表明：与正常癌旁组织相比,胃癌中miR-543是高表达的、SIRT1是低表达的,而且miR-543的表达与SIRT1的表达呈现显著的负相关关系。对患者临床病理特征进一步分析发现：miR-543的表达与患者的肿瘤大小、临床分期、TNM分期和淋巴转移显著相关,与患者的性别、年龄和肿瘤浸润无关。结论：1.miR-543通过与SIRT1 mRNA 3’-UTR区两个不同位点相结合靶向下调SIRT1的表达。2.miR-543通过下调SIRT1的表达促进细胞增殖、克隆形成和细胞周期进展。3.miR-543在胃癌组织中高表达,与SIRT1的表达有明显的负相关关系,miR-543的表达和胃癌患者肿瘤大小、临床分期、TNM分期和淋巴转移显著相关。