研究背景和目的：乙型肝炎病毒（HBV）属于嗜肝非细胞病变的DNA病毒，能诱导不同严重程度的各种坏死性肝炎。HBV持续感染可导致慢性肝炎，可进一步发展为肝硬化和肝癌。虽然对于HBV感染慢性化的潜在机制研究已经有很多的阐述，但究竟是什么原因导致了慢性HBV患者体内的抗病毒免疫应答低下，目前还不完全清楚。有大量的文献表明调节性T细胞（Treg）在慢性乙型肝炎中抑制机体的抗病毒T细胞反应中扮演了重要角色。但是目前文献关于Treg细胞在HBV感染慢性化的作用机制还存有争议，一些研究认为：与正常对照组和HBV急性感染恢复期相比，HBV病毒携带者在外周血和肝脏中的Treg频率增高，并且与HBV DNA病毒载量呈正相关，认为Treg细胞有利于HBV病毒的持续感染；然而，也有一些研究却没能检测到正常对照和HBV病毒携带者在外周血中Treg频率的差异。导致这些研究结果不一致的原因有：1)在HBV感染中对Treg细胞的表型和功能的界定标准不一样。比如，有些研究中只采用CD4^<sup>+CD25^<sup>+来界定Treg细胞，有些研究中用CD4^<sup>+CD25highFoxp3^<sup>+来界定Treg细胞；2)要精确将慢乙肝患者进行免疫学分期，HBV慢性感染的不同阶段其机体内的免疫学状态是彻底不同的。与小鼠的Treg细胞不一样，人体内的Treg细胞在表型和功能都是异质、可塑的一群细胞。Treg细胞通过不同的功能分子执行抑制效应，比如IL-10、TGF-β、颗粒酶B、穿孔素、CTLA-4、GITR、Lag-3和CD39/CD73等。Treg细胞可能在不同的疾病或者疾病的不同阶段使用不同的抑制机制发挥作用。2007年有两家实验室分别鉴定了在人和小鼠的Treg细胞表面大量表达CD39分子。CD39分子是一种钙、镁离子依赖的胞外三磷酸核苷双磷酸水解酶，其主要作用将胞外ATP和ADP水解为AMP，AMP又可在胞外5’-核苷酸酶CD73的作用下水解为腺苷，腺苷可与效应T细胞膜上的A2AR结合，从而启动cAMP依赖的免疫负调。有文献报道与CD25和CTLA-4相比，CD39分子更适合做Treg的表面标志来筛选Treg细胞。已有的研究提示，CD39^<sup>+Treg细胞在很多疾病中发挥了重要的作用：1)CD39^<sup>+Treg细胞的比例增多，抑制了CD8^<sup>+CTL细胞的活化，形成免疫忽视，比如在头颈癌、HIV感染、和淋巴瘤等；2)CD39⁺Treg细胞的比例减少，灭活ATP危险信号的能力减弱，有利于DC的成熟，并促进DC分泌促炎因子IL-1β，继而促进Th17的活化，发挥促炎效应，比如在IBD、MS、SLE和移植排斥反应等疾病。虽然CD39⁺Treg细胞在一些疾病中的重要作用已有研究报道，但是，目前还没有CD39⁺Treg细胞参与HBV感染慢性化的研究报道。慢性HBV感染的免疫分期分为免疫耐受期、免疫清除期、低复制期和再活跃期，免疫清除期和免疫耐受期的机体免疫学状态是彻底不同的，而CD39⁺Treg细胞既可以抑制效应T细胞清除病毒，导致免疫耐受，又可以灭活ATP信号，减少促炎因子的分泌，有利于抑制炎症。因此，我们推测：CD39⁺Treg细胞可能在HBV慢性化的进程中发挥了重要的作用。在我们的研究中，我们首先鉴定了CD39⁺Treg细胞的表型和功能；接着我们将收集的研究对象分为四组：健康对照组、AsCs（无症状的免疫携带者）、CAH组（慢性活动性肝炎）和ACLF组（慢加急性肝衰竭），分析了这四组研究对象的外周血和肝内的CD39⁺Treg的频率和表型特点；最后，用Spearman’s相关性检验方法分析了CD39⁺Treg的频率和临床指标的相关性。通过以上研究拟为HBV感染慢性化的机制找寻一条新的线索。结果1. CD39分子主要表达在FoxP3^high的效应性Treg细胞表面在我们的研究中，通过流式检测发现，无论是健康人还是不同分期的HBV患者，CD39分子在CD4⁺T细胞的表达频率个体之间差异很大，从0.5%到20%，且其表达的高低与后续的CD39分子在Treg细胞上的分布相关联。因此，为了对后续CD39分子与HBV感染的研究更为详细，我们根据分析数据后所得到规律，把所有研究对象按CD39分子在CD4⁺T细胞上的表达高低将其分为CD39low组（<5%）、CD39int组（5-10%）和CD39high组（>10%）。首先，我们对CD39⁺Treg细胞的表型和功能进行鉴定，研究结果提示：1)CD39分子在CD4⁺T细胞的表达高低影响了其在Treg细胞上的分布，CD39⁺Treg细胞占总Treg比例的平均值为：CD39low （17%）、CD39int （45%） and CD39high （65%）。2)但是无论CD39分子的表达高低，70%以上的CD39分子都表达在CD45RA-的记忆表型的CD4⁺T细胞中。Sakaguchi实验室以CD45RA和FoxP3两个标记将人的调节性T细胞分为三个亚群：CD45RA⁺Foxp3^low静息态Treg细胞、CD45RA-Foxp3high效应态Treg细胞和CD45RA-Foxp^low分泌态Treg细胞，他们的研究结果表明这三个亚群能很好地评价不同生理和病理情况下Tregs的分化动力学。我们也检测了CD39分子在上述三个Treg亚群中的表达情况，结果表明：CD39分子主要表达在CD45RA-FoxP3^high效应态的Treg细胞群中。我们还进一步检测了在Treg细胞中CD39分子与其他Treg重要功能分子的共表达情况，结果提示：与CD39-Treg细胞相比，CD39⁺Treg与CTLA-4、Ki-67和HLA-DR共表达的频率高出一倍。最后，我们还做了CD39⁺Treg细胞的抑制功能实验，结果提示：CD39⁺Treg细胞的抑制功能较CD39-Treg细胞更强。2. CD39⁺Treg细胞的频率在慢性乙肝感染的不同阶段是动态变化的我们按照临床诊断和相关检验结果，将研究对象分为4组：健康对照组、AsCs组、CAH组和ACLF组，用流式方法检测了四组人群中总Treg细胞和CD39⁺Treg细胞频率，研究结果提示：1)CD39分子在CD4⁺T细胞的频率在四组之间没有明显的差异；2)CD39分子在FoxP3⁺Treg细胞的比例在四组中是动态变化的：与健康组相比，在AsCs组中其频率显著增高（P <0.05），但在CAH和ACLF组中其频率又显著下降，基本恢复至健康对照组水平；3)总Treg细胞的频率在四组中的变化趋势却与CD39⁺Treg细胞不同：与健康对照组相比，AsCs组没有明显变化，但在CAH和ACLF组中却显著升高。CAH和ACLF的特征是血清ALT水平升高，肝脏局部发生肝细胞坏死和炎性细胞的浸润，Treg频率的升高可能是在高炎症状态下代偿性的增高，而CD39⁺Treg细胞的频率变化有可能更真实的反映了在慢性HBV感染中从AsCs的“免疫耐受”到CAH、ACLF的“免疫过度反应”的免疫微环境的动态变化。3. CD39⁺Treg细胞的频率与HBV DNA拷贝数呈正相关，与血清ALT水平呈负相关HBV拷贝数、ALT水平和HBeAg的血清学转换是评价慢乙肝疾病进展的3个重要临床指标。我们把总Treg和CD39⁺Treg的频率分别与临床参数做相关性分析，结果表明：1)慢乙肝患者的外周血中，CD39⁺Treg的频率与HBV DNA拷贝数呈正相关，尤其是在AsCs组中，但总Treg细胞频率未发现相关性，这个与已有的研究报道不一致，分析原因可能是我们用来界定总Treg细胞的标记只有CD4⁺FoxP3⁺两个指标，而在总Treg频率与HBV拷贝数有相关性的研究中，界定Treg细胞用的是CD4⁺FoxP3⁺CD25⁺三个指标；2)慢乙肝患者的外周血中，CD39⁺Treg的频率与ALT水平呈负相关，尤其是在CAH组中，但ACLF组未能发现相关性，分析原因可能是ACLF病人发生了“胆酶分离”的现象，ALT水平已不能体现肝局部的炎症程度。然而，总Treg频率未能发现与ALT水平有相关性；3)慢乙肝患者的外周血中，CD39⁺Treg的频率与HBeAg的表达没有相关性，分析原因可能是我们的研究对象对HBeAg的检测是定性而不是定量，可能掩盖了CD39⁺Treg频率与HBeAg水平的相关性；4)除此之外，我们还比较了CD39分子的表达高低与HBV拷贝数、ALT水平和HBeAg的相关性，结果表明：与CD39high组相比，CD39low组的血清ALT水平升高，HBV病毒载量显著降低。这些结果再次提示：CD39⁺Treg细胞可能参与了HBV感染慢性化的病程。4. CD39⁺Treg细胞在炎症肝局部大量浸润我们用流式检测了HCC病人（HBV⁺）手术摘除的癌旁组织（HAI:S3/G3）LIL的CD39⁺Treg细胞的表达频率，结果提示与外周血基本一致，CD39⁺Treg占总Treg细胞的46%，由于肝穿标本的取材困难和组织太少，我们用免疫组化和免疫荧光的方法检测了CD39⁺Treg细胞在肝炎组织中的定位和共表达，结果提示：CD39⁺FoxP3⁺的细胞在炎症肝组织的汇管区内大量浸润。结论在我们的研究中，我们首次将CD39⁺Treg细胞引入HBV慢性感染的机制研究中，CD39⁺Treg细胞的频率在HBV慢性化感染进程中是动态变化的，在免疫耐受期是升高的，到免疫清除期是降低的，而且CD39⁺Treg细胞的频率与慢乙肝病人的ALT水平呈负相关，与HBV DNA拷贝数呈正相关。由于CD39分子在个体之间表达差异大，我们还首次根据CD39分子在CD4⁺T细胞的频率将研究对象再划分为CD39low组、CD39int组、CD39high组。与CD39high组相比，CD39low组的ALT水平较高，HBV DNA拷贝数的水平较低。我们还鉴定了CD39分子主要表达CD45RA-FoxP3^high的效应记忆Treg细胞上，且具有更强的抑制功能。综上所述，通过我们的研究结果可以推测，CD39⁺Treg细胞在HBV感染慢性化进程中可能发挥了重要的作用，提示CD39⁺Treg细胞可作为慢性HBV感染的治疗和免疫监测的一个有效的靶标。在后续的研究中我们将关注在HBV慢性感染中，Treg细胞上的CD39分子如何被肝脏微环境调控以及发挥抑制功能的确切机制等，以更深入了解HBV感染慢性化的机制。