论文部分内容阅读
乳腺炎是由各种生理生化因素综合作用而导致的炎症，给中国乃至全世界的养牛业带来了巨大的经济损失。以往国内外针对此问题的报道大多集中于抗生素添加的缓解作用，但随着研究的深入，细胞因子对乳腺炎的治疗作用开始被关注。Chemerin是一种具有自分泌和旁分泌功能的细胞因子，目前已证实在脂肪、乳腺及肝脏等多种组织表达。Chemerin最初被鉴定为抗原呈递细胞的趋化因子，与G蛋白偶联受体CMKLR1结合参与调控多种炎症反应，具有抗炎和促炎双重功效，这主要决定于Chemerin的酶切位点和方式。乳腺上皮细胞已被证明是乳腺免疫防御的重要组成部分，而细胞凋亡是乳腺上皮细胞受到各种形式损伤后的自我修复过程。NF-κB作为中心调节因子，其活化可引发一系列包括细胞增殖、炎症和凋亡等生理学功能的变化。目前关于Chemerin对大型哺乳动物炎症的作用知之甚少，尤其是奶牛乳腺炎。因此，本研究以奶牛乳腺上皮细胞系为模型，运用重组蛋白Chemerin作用于体外培养的奶牛乳腺上皮细胞，研究Chemerin与炎症及细胞凋亡的关系，并探索NF-κB途径的调控功能，从而完善乳腺疾病的发病机制。
1.Chemerin在奶牛临床性乳房炎组织中高表达和诱导奶牛乳腺上皮细胞发生炎症
分别采集3头正常和3头患有临床性乳房炎的奶牛乳腺组织，在RNA提取物中检测发现，Chemerin与受体CMKLR-1的mRNA在炎性乳腺组织中显著上调(P＜0.01);Chemerin蛋白结果与转录结果一致，在炎性乳腺组织中同样高表达(P＜0.01)，提示Chemerin/CMKLR1轴可能参与奶牛乳腺炎的发生发展。
接下来以奶牛乳腺上皮细胞为材料，在添加Chemerin的培养基内培养细胞12h、24h和48h，旨在探讨Chemerin在不同时间段对乳腺上皮细胞炎症反应的影响。结果显示，Chemerin组IL-1β和IL-6的mRNA和蛋白表达以时间依赖性的方式显著上调(P＜0.05);Chemerin处理后ROS的分泌也以时间依赖性的方式明显增加(P＜0.01),说明Chemerin通过调控炎性因子IL-1β和IL-6的分泌及炎性介质ROS的积累促进奶牛乳腺上皮细胞炎性反应。
2.Chemerin激活奶牛乳腺上皮细胞NF-κB信号通路和诱导细胞凋亡
用Chemerin处理奶牛乳腺上皮细胞12h、24h和48h后检测NF-κB蛋白磷酸化水平，同时分析Chemerin作用不同时间段后对乳腺上皮细胞凋亡的作用。结果表明，Chemerin处理奶牛乳腺上皮细胞12h(P＜0.05)、24h(P＜0.05)和48h(P＜0.01)后NF-κB蛋白磷酸化水平逐渐上调;免疫荧光染色检测发现，对照组中NF-κB蛋白主要表达于细胞质和核周围，而在Chemerin处理组中，NF-κB蛋白随着时间的推移发生核转移。进一步通过免疫印迹检测发现，细胞核中NF-κB蛋白磷酸化水平随着Chemerin的处理时间延长显著增加(P＜0.05)，而细胞质中的结果正好相反(P＜0.05)。这些结果表明，高剂量Chemerin可活化奶牛乳腺上皮细胞中NF-κB途径。
为了分析Chemerin在诱导奶牛乳腺上皮细胞发生炎症后如何影响细胞结构，本研究通过荧光染料碘化丙啶(PI)和膜联蛋白V-FITC(AV)双染区分细胞状态后，利用流式细胞术评估细胞凋亡率。结果发现，Chemerin以时间依赖性上调奶牛乳腺上皮细胞凋亡率，但12h没有差异，在24h(P＜0.05)和48h(P＜0.01)达到显著水平。与此同时凋亡关键基因Bax/Bcl-2无论是在转录水平上还是翻译水平上都以时间依赖性显著升高(P＜0.05)。此外，Caspase-3的表达在翻译水平上也逐渐升高，在24h(P＜0.01)和48h(P＜0.01)达到显著水平。这些数据证实Chemerin可启动凋亡级联反应诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡。为了进一步探究NF-κB通路对Chemerin诱导的乳腺上皮细胞炎症和凋亡的作用，本研究将选取Chemerin处理24h进行后续的试验。
3.Chemerin激活NF-κB信号通路调控奶牛乳腺上皮细胞炎症反应和凋亡
在本试验中，NF-κB抑制剂PDTC预先处理细胞3h，随后再用Chemerin处理细胞24h进行研究，分为对照组、Chemerin组、PDTC组和PDTC+Chemerin组。免疫印迹结果表明PDTC能明显降低Chemerin诱导的NF-κB蛋白磷酸化水平(P＜0.01),说明Chemerin活化的NF-κB途径能被PDTC有效抑制。在此基础上进一步检测发现，Chemerin组IL-1β和IL-6的mRNA和蛋白表达都显著上调(P＜0.05)，而PDTC的预处理逆转了Chemerin对炎症基因的这种作用(P＜0.05)。流式细胞术检测的结果表明，PDTC+Chemerin组奶牛乳腺上皮细胞凋亡率较Chemerin组明显降低(P＜0.05)，与此同时，PDTC+Chemerin组基因Bax/Bcl-2的比值在转录和翻译水平上也显著下降(P＜0.05)。此外，PDTC也扭转了Chemerin对奶牛乳腺上皮细胞中Caspase-3蛋白的促进作用(P＜0.01)。结果表明，Chemerin通过活化NF-κB途径对相关基因的转录进行调控，从而促进奶牛乳腺上皮细胞中炎症反应并诱导细胞凋亡。
1.Chemerin在奶牛临床性乳房炎组织中高表达和诱导奶牛乳腺上皮细胞发生炎症
分别采集3头正常和3头患有临床性乳房炎的奶牛乳腺组织，在RNA提取物中检测发现，Chemerin与受体CMKLR-1的mRNA在炎性乳腺组织中显著上调(P＜0.01);Chemerin蛋白结果与转录结果一致，在炎性乳腺组织中同样高表达(P＜0.01)，提示Chemerin/CMKLR1轴可能参与奶牛乳腺炎的发生发展。
接下来以奶牛乳腺上皮细胞为材料，在添加Chemerin的培养基内培养细胞12h、24h和48h，旨在探讨Chemerin在不同时间段对乳腺上皮细胞炎症反应的影响。结果显示，Chemerin组IL-1β和IL-6的mRNA和蛋白表达以时间依赖性的方式显著上调(P＜0.05);Chemerin处理后ROS的分泌也以时间依赖性的方式明显增加(P＜0.01),说明Chemerin通过调控炎性因子IL-1β和IL-6的分泌及炎性介质ROS的积累促进奶牛乳腺上皮细胞炎性反应。
2.Chemerin激活奶牛乳腺上皮细胞NF-κB信号通路和诱导细胞凋亡
用Chemerin处理奶牛乳腺上皮细胞12h、24h和48h后检测NF-κB蛋白磷酸化水平，同时分析Chemerin作用不同时间段后对乳腺上皮细胞凋亡的作用。结果表明，Chemerin处理奶牛乳腺上皮细胞12h(P＜0.05)、24h(P＜0.05)和48h(P＜0.01)后NF-κB蛋白磷酸化水平逐渐上调;免疫荧光染色检测发现，对照组中NF-κB蛋白主要表达于细胞质和核周围，而在Chemerin处理组中，NF-κB蛋白随着时间的推移发生核转移。进一步通过免疫印迹检测发现，细胞核中NF-κB蛋白磷酸化水平随着Chemerin的处理时间延长显著增加(P＜0.05)，而细胞质中的结果正好相反(P＜0.05)。这些结果表明，高剂量Chemerin可活化奶牛乳腺上皮细胞中NF-κB途径。
为了分析Chemerin在诱导奶牛乳腺上皮细胞发生炎症后如何影响细胞结构，本研究通过荧光染料碘化丙啶(PI)和膜联蛋白V-FITC(AV)双染区分细胞状态后，利用流式细胞术评估细胞凋亡率。结果发现，Chemerin以时间依赖性上调奶牛乳腺上皮细胞凋亡率，但12h没有差异，在24h(P＜0.05)和48h(P＜0.01)达到显著水平。与此同时凋亡关键基因Bax/Bcl-2无论是在转录水平上还是翻译水平上都以时间依赖性显著升高(P＜0.05)。此外，Caspase-3的表达在翻译水平上也逐渐升高，在24h(P＜0.01)和48h(P＜0.01)达到显著水平。这些数据证实Chemerin可启动凋亡级联反应诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡。为了进一步探究NF-κB通路对Chemerin诱导的乳腺上皮细胞炎症和凋亡的作用，本研究将选取Chemerin处理24h进行后续的试验。
3.Chemerin激活NF-κB信号通路调控奶牛乳腺上皮细胞炎症反应和凋亡
在本试验中，NF-κB抑制剂PDTC预先处理细胞3h，随后再用Chemerin处理细胞24h进行研究，分为对照组、Chemerin组、PDTC组和PDTC+Chemerin组。免疫印迹结果表明PDTC能明显降低Chemerin诱导的NF-κB蛋白磷酸化水平(P＜0.01),说明Chemerin活化的NF-κB途径能被PDTC有效抑制。在此基础上进一步检测发现，Chemerin组IL-1β和IL-6的mRNA和蛋白表达都显著上调(P＜0.05)，而PDTC的预处理逆转了Chemerin对炎症基因的这种作用(P＜0.05)。流式细胞术检测的结果表明，PDTC+Chemerin组奶牛乳腺上皮细胞凋亡率较Chemerin组明显降低(P＜0.05)，与此同时，PDTC+Chemerin组基因Bax/Bcl-2的比值在转录和翻译水平上也显著下降(P＜0.05)。此外，PDTC也扭转了Chemerin对奶牛乳腺上皮细胞中Caspase-3蛋白的促进作用(P＜0.01)。结果表明，Chemerin通过活化NF-κB途径对相关基因的转录进行调控，从而促进奶牛乳腺上皮细胞中炎症反应并诱导细胞凋亡。