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骨骼肌是动物体内最丰富的组织，出生后肌肉的生长发育和再生过程主要依靠骨骼肌卫星细胞的增殖和分化。已有研究表明骨骼肌卫星细胞的增殖和分化过程受到多种与肌肉发育相关的信号通路、转录因子及表观修饰的调控，但是在不同猪种骨骼肌的发育过程中的调控作用和机制尚不清楚。我们选择在生长速度和肉质方面存在差异的约克夏猪和监利猪为研究对象，对两猪种骨骼肌卫星细胞增殖和分化6个阶段进行RNA-seq测序，以分析调控不同猪种骨骼肌卫星细胞增殖和分化的基因表达模式、关键信号通路并对差异表达基因进行功能验证。主要研究结果如下：
(1)利用组织块消化法分离了监利猪和约克夏猪的骨骼肌卫星细胞，通过免疫荧光实验发现，PAX7阳性细胞的比例为98％，纯度较高；MyoD和MyHC荧光活性较强，细胞的增殖和分化能力较好，分离出的卫星细胞可用于后续的实验。光学显微镜下观察骨骼肌卫星细胞在增殖0h、24h(分化0h)，分化12h、24h、48h和72h的形态，分化48h时大量肌管生成。通过EdU增殖实验和WB实验证明监利猪骨骼肌卫星细胞的增殖和分化能力比约克夏猪强。
(2)将约克夏猪和监利猪骨骼肌卫星增殖过程中筛选到的差异基因聚类分析，显示三个生物学重复聚成一类。监利猪上调基因数目比例高于约克夏猪，两猪种卫星细胞增殖过程中基因的表达模式有差异。发现了与卫星细胞增殖密切相关的基因有肌肉特异转录因子MYOD1和SOX8，骨骼肌发育相关基因HES6和RCOR2。
(3)将约克夏猪和监利猪骨骼肌卫星分化过程中相邻两个时期筛选到的差异基因聚类分析，YK12h和YK24h表达模式相似，YK48h和YK72h表达模式相似，YK0h上调基因数目较多，单独聚成一类；JL0h,JL12h和JL24h模式更相近，JL48h和JL72h聚成一类。两猪种分化过程中的差异基因共同显著富集到的表达模式有7种，还有4种表达模式只在监利猪中显著富集，2种只在约克夏猪中显著富集。基因ANKRD1、CSRP3F、LNC和KLF6在肌卫星细胞的分化过程中有重要的作用。
(4)约克夏猪骨骼肌卫星增殖过程中共筛选到549个差异基因，其中表达量上调的有419个，下调的130个。监利猪骨骼肌卫星细胞中筛选到358个差异基因，其中上调的基因313个，下调基因45个。GO富集分析结果显示：约克夏猪中上调的基因显著富集在信号转导，分子功能调控等GOterms；下调的基因主要富集在细胞骨架，受体结合等GOterms。监利猪中上调的基因显著富集在细胞生长，发育过程等GOterms;下调的基因主要富集在免疫机能系统进程，细胞生长等GOterms。KEGG结果显示：约克夏猪中上调的基因显著富集在神经配体互作，细胞分子粘附，Rap1信号通路。监利猪中上调的基因显著富集在cGMP-PKG和心脏疾病相关的信号通路；下调的基因显著富集在细胞互作和糖尿病等信号通路。对比增殖0h和24h时监利猪和约克夏猪骨骼肌卫星细胞中基因的表达，共筛选到3030个差异表达基因。富集结果显示，这些差异基因主要富集在细胞粘附，生长和信号转导相关的生物学过程。主要富集到的信号通路有钙离子信号通路、PI3K-Akt信号通路和多种肌肉疾病信号通路。
(5)比较约克夏猪和监利骨骼肌卫星细胞相邻两个分化时期分别筛选到3357和7261个差异基因，GO结果显示约克夏猪中的差异基因显著富集到与细胞分化和融合相关的GOterms，其中分化早期的差异基因显著富集到了DNA复制和代谢过程的GOterms，分化晚期的差异基因显著富集到微管运动相关的GOterms；监利猪中的差异基因显著富集到跨膜运动、细胞粘附，细胞骨架等GOterms，分化早期和晚期的差异基因都显著富集到基于微管的运动相关的生物学过程，说明监利猪骨骼肌卫星细胞启动分化的时间早于约克夏猪。对差异基因进行KEGG通路富集分析，显示约克夏猪中的差异基因显著富集在脂肪代谢，DNA复制和修复相关的信号通路，其中分化早期的差异基因显著富集在细胞增殖相关的信号通路，分化晚期的差异基因主要富集在肌肉疾病和骨骼肌发育相关的信号通路；监利猪中的差异基因显著富集在钙离子信号通路和肌肉疾病相关信号通路，分化早期和晚期的差异基因都显著富集在损伤修复，增殖和分化相关的信号通路。比较监利猪和约克夏猪骨骼肌卫星细胞分化的5个时期，筛选到7730个差异基因，分化12h的差异表达基因最多。我们发现这些DEG主要是富集在微管运动，细胞生长相关的GOterms和调控卫星细胞分化的信号通路。每个比较组合的差异基因都富集到的PI3K-Akt信号通路是导致两猪种骨骼肌卫星分化能力差异的关键通路。利用WGCNA对差异基因进行共表达网络分析，这些基因被划分到14个模块中，其中绿色模块的基因和JL12h的样品相关系数较高。这个模块的基因主要被富集到TGF-beta、Wnt、PI3K-Akt等肌肉发育相关通路，其中S100A6、PSAT1、IGFBP2、HIST1H1D、RF00002、CITED2、KDELR2、MXD4和MYC基因是调控两猪种卫星细胞早期分化差异的关键基因。将分化过程中高表达的基因KEGG富集分析，显示核糖体信号通路中是富集到的最显著的通路。
(6)在小鼠的C2C12细胞中，通过基因敲减实验发现KLF6可以促进C2C12细胞增殖，抑制分化。转染miR-543的模拟物和抑制剂后发现miR-543可以抑制C2C12细胞增殖，促进分化。功能恢复实验证明KLF6可以挽救miR-543的抑制剂对C2C12细胞的调控。增殖实验和免疫荧光实验证明KLF6基因和miR-543在猪骨骼肌卫星细胞中的功能和在小鼠C2C12细胞中相同。
(1)利用组织块消化法分离了监利猪和约克夏猪的骨骼肌卫星细胞，通过免疫荧光实验发现，PAX7阳性细胞的比例为98％，纯度较高；MyoD和MyHC荧光活性较强，细胞的增殖和分化能力较好，分离出的卫星细胞可用于后续的实验。光学显微镜下观察骨骼肌卫星细胞在增殖0h、24h(分化0h)，分化12h、24h、48h和72h的形态，分化48h时大量肌管生成。通过EdU增殖实验和WB实验证明监利猪骨骼肌卫星细胞的增殖和分化能力比约克夏猪强。
(2)将约克夏猪和监利猪骨骼肌卫星增殖过程中筛选到的差异基因聚类分析，显示三个生物学重复聚成一类。监利猪上调基因数目比例高于约克夏猪，两猪种卫星细胞增殖过程中基因的表达模式有差异。发现了与卫星细胞增殖密切相关的基因有肌肉特异转录因子MYOD1和SOX8，骨骼肌发育相关基因HES6和RCOR2。
(3)将约克夏猪和监利猪骨骼肌卫星分化过程中相邻两个时期筛选到的差异基因聚类分析，YK12h和YK24h表达模式相似，YK48h和YK72h表达模式相似，YK0h上调基因数目较多，单独聚成一类；JL0h,JL12h和JL24h模式更相近，JL48h和JL72h聚成一类。两猪种分化过程中的差异基因共同显著富集到的表达模式有7种，还有4种表达模式只在监利猪中显著富集，2种只在约克夏猪中显著富集。基因ANKRD1、CSRP3F、LNC和KLF6在肌卫星细胞的分化过程中有重要的作用。
(4)约克夏猪骨骼肌卫星增殖过程中共筛选到549个差异基因，其中表达量上调的有419个，下调的130个。监利猪骨骼肌卫星细胞中筛选到358个差异基因，其中上调的基因313个，下调基因45个。GO富集分析结果显示：约克夏猪中上调的基因显著富集在信号转导，分子功能调控等GOterms；下调的基因主要富集在细胞骨架，受体结合等GOterms。监利猪中上调的基因显著富集在细胞生长，发育过程等GOterms;下调的基因主要富集在免疫机能系统进程，细胞生长等GOterms。KEGG结果显示：约克夏猪中上调的基因显著富集在神经配体互作，细胞分子粘附，Rap1信号通路。监利猪中上调的基因显著富集在cGMP-PKG和心脏疾病相关的信号通路；下调的基因显著富集在细胞互作和糖尿病等信号通路。对比增殖0h和24h时监利猪和约克夏猪骨骼肌卫星细胞中基因的表达，共筛选到3030个差异表达基因。富集结果显示，这些差异基因主要富集在细胞粘附，生长和信号转导相关的生物学过程。主要富集到的信号通路有钙离子信号通路、PI3K-Akt信号通路和多种肌肉疾病信号通路。
(5)比较约克夏猪和监利骨骼肌卫星细胞相邻两个分化时期分别筛选到3357和7261个差异基因，GO结果显示约克夏猪中的差异基因显著富集到与细胞分化和融合相关的GOterms，其中分化早期的差异基因显著富集到了DNA复制和代谢过程的GOterms，分化晚期的差异基因显著富集到微管运动相关的GOterms；监利猪中的差异基因显著富集到跨膜运动、细胞粘附，细胞骨架等GOterms，分化早期和晚期的差异基因都显著富集到基于微管的运动相关的生物学过程，说明监利猪骨骼肌卫星细胞启动分化的时间早于约克夏猪。对差异基因进行KEGG通路富集分析，显示约克夏猪中的差异基因显著富集在脂肪代谢，DNA复制和修复相关的信号通路，其中分化早期的差异基因显著富集在细胞增殖相关的信号通路，分化晚期的差异基因主要富集在肌肉疾病和骨骼肌发育相关的信号通路；监利猪中的差异基因显著富集在钙离子信号通路和肌肉疾病相关信号通路，分化早期和晚期的差异基因都显著富集在损伤修复，增殖和分化相关的信号通路。比较监利猪和约克夏猪骨骼肌卫星细胞分化的5个时期，筛选到7730个差异基因，分化12h的差异表达基因最多。我们发现这些DEG主要是富集在微管运动，细胞生长相关的GOterms和调控卫星细胞分化的信号通路。每个比较组合的差异基因都富集到的PI3K-Akt信号通路是导致两猪种骨骼肌卫星分化能力差异的关键通路。利用WGCNA对差异基因进行共表达网络分析，这些基因被划分到14个模块中，其中绿色模块的基因和JL12h的样品相关系数较高。这个模块的基因主要被富集到TGF-beta、Wnt、PI3K-Akt等肌肉发育相关通路，其中S100A6、PSAT1、IGFBP2、HIST1H1D、RF00002、CITED2、KDELR2、MXD4和MYC基因是调控两猪种卫星细胞早期分化差异的关键基因。将分化过程中高表达的基因KEGG富集分析，显示核糖体信号通路中是富集到的最显著的通路。
(6)在小鼠的C2C12细胞中，通过基因敲减实验发现KLF6可以促进C2C12细胞增殖，抑制分化。转染miR-543的模拟物和抑制剂后发现miR-543可以抑制C2C12细胞增殖，促进分化。功能恢复实验证明KLF6可以挽救miR-543的抑制剂对C2C12细胞的调控。增殖实验和免疫荧光实验证明KLF6基因和miR-543在猪骨骼肌卫星细胞中的功能和在小鼠C2C12细胞中相同。