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羊传染性口疮(Orf)是由副痘病毒引起的在山羊和绵羊群体中具有高传染性的人畜共患病。尽管目前有减毒和灭活的orf病毒(ORFV)疫苗，但它们既不能引起持久免疫，也不能避免再次感染。KISSI基因编码的吻素(Kisspeptin)通过与GPR54受体结合调控下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamic-pituitary-gonadalaxis，HPG轴)，尽管kisspeptin作为促性腺激素释放激素(GnRH)分泌的“看门人”的功能已被大家熟知，但是kisspeptin激素免疫对山羊繁殖和肉质的影响还有待研究。本研究旨在构建由由ORFV包被蛋白基因(B2Z)和Kisspeptin-54蛋白基因构成的重组二价DNA疫苗，检测其对羊口疮病毒的免疫原性及在大鼠和山羊中的免疫去势作用，并探究其对夷陵山羊生长性能、胴体特性和肉质的影响。
(1)检索并合成B2L基因和Kisspeptin-54基因序列，将其克隆到无抗生素抗性基因的PVAX-asd载体中，构建得到Pvax-B2L-asd(PB2L-asd)和PVAX-B2L-Kisspeptin-54-asd(PBK-asd)质粒。随后，用免疫信息学工具分析融合蛋白的三维结构和理化特性，分别用RT-PCR和蛋白质印迹技术检测融合质粒在转录和翻译水平的表达情况。结果表明PB2L-asd和重组PBK-asd质粒具有抗原性、非过敏性和稳定性的特点，并且能够成功在HeLa细胞中表达。
(2)将24只8周龄雄性SD大鼠随机均分为PBK-asd免疫组和PVAX-asd组(对照组)，分别肌肉注射100略/剂的PBK-asdDNA疫苗和PVAX-asd空质粒，加强免疫2次。检测发现，从第4周至结束，PBK-asd免疫组的脾淋巴细胞增殖率，CD4+T细胞含量，抗B2L抗体和Th1细胞因子标记(IL-2,INF-γ，TNF-α)水平均显著高于对照组(P<0.05)。
(3)将15只5月龄雄性夷陵山羊随机均分为PBK-asd免疫组、PB2L-asd免疫组和PVAX-asd免疫组(对照组)。分别肌肉注射1μg/剂的PBK-asdDNA疫苗、PB2L-asd质粒和PVAX-asd空质粒，随后加强免疫2次。检测发现，PBK-asd和PB2L-asd疫苗诱导产生了抗B2L抗体和Th1细胞因子标记(IL-2，INF-γ，TNF-α)，并且从第8周开始，PBK-asd免疫组的抗B2L抗体应答水平始终显著高于PB2L-asd免疫组(P<0.05)。
(4)本研究将36只8周龄的SD雄性大鼠随机均分为PBK-asd免疫组、PVAX-asd免疫组(对照组)和手术去势组，按前述方法免疫。结果显示，PBK-asd免疫刺激了抗kisspeptin抗体应答(P<0.05)，血清中睾酮和黄体生成素(LH)的浓度显著降低(P<0.05)。而手术去势组血清LH水平显著高于对照组(P<0.05)。本研究构建的重组PBK-asdDNA疫苗显著抑制了大鼠的睾丸生长和精子发生，表现出了明显的去势效果。
(5)将15只5月龄夷陵公山羊随机均分为PBK-asd免疫去势组、PVAX-asd免疫组(对照组)、手术去势组，按前述方法免疫。结果显示，PBK-asd免疫组的血清的抗kisspeptin抗体含量显著升高(P<0.05)，血清的促卵泡激素(FSH)、LH和睾酮水平显著降低(P<0.05)，并且睾丸发育、精子发生和性行为也明显受到抑制。PBK-asd免疫去势组和手术去势组的下丘脑中KISS1基因表达水平显著升高(P<0.05)PBK-asd免疫抑制了下丘脑雄激素受体(AR)、G蛋白偶联受体(GPR54)、促性腺激素释放激素(GnRH)，垂体促性腺激素释放激素受体(GnRHR)、促卵泡素(FSH6)、促黄体素(LHb)，以及睾丸的促卵泡素受体(FSHR)和促黄体素受体(ZHR)的表达；与之相反地，在手术去势组，除AR外的其他上述基因的表达均显著上调(P<0.05)。
(6)将15只5月龄雄性夷陵山羊随机分为PBK-asd免疫去势组、PVAX-asd免疫组(对照组)和手术去势组，每组各5头，按前述方法免疫。结果表明，接种PBK-asd疫苗的山羊的生长激素水平、体重、平均日增重(ADG)和胴体重与对照组相比无显著差异(P<0.05)，而手术去势组的体重、ADG和胴体重显著低于PBK-asd免疫组和对照组(P<0.05)。三种处理间的山羊胴体性状(屠宰率、眼肌面积、脂肪厚度)和肉质性状(pH、肉色、蒸煮损失、滴水损失、剪切力)无显著差异。此外，没有检测到PBK-asd质粒与宿主基因组整合的情况，说明接种了PBK-asd疫苗的山羊肉是安全的、可食用的。
(7)PB2L-asd和PBK-asd疫苗均能引起针对Orf病毒被膜蛋白(B2L)的体液免疫和细胞免疫应答。PBK-asdDNA疫苗通过在体内产生抗kisspeptin抗体中和内源的kisspeptin,从而破坏正常的下丘脑-垂体-睾丸信号通路，实现免疫去势。此外，本研究结果表明，PBK-asdDNA疫苗是安全的，不会影响山羊的肉质和胴体性状。综上所述，本研究研发的重组B2L和Kisspeptin-54的DNA疫苗是一种有前景的，具备免疫ORFV和山羊免疫去势功能的二价疫苗。
(1)检索并合成B2L基因和Kisspeptin-54基因序列，将其克隆到无抗生素抗性基因的PVAX-asd载体中，构建得到Pvax-B2L-asd(PB2L-asd)和PVAX-B2L-Kisspeptin-54-asd(PBK-asd)质粒。随后，用免疫信息学工具分析融合蛋白的三维结构和理化特性，分别用RT-PCR和蛋白质印迹技术检测融合质粒在转录和翻译水平的表达情况。结果表明PB2L-asd和重组PBK-asd质粒具有抗原性、非过敏性和稳定性的特点，并且能够成功在HeLa细胞中表达。
(2)将24只8周龄雄性SD大鼠随机均分为PBK-asd免疫组和PVAX-asd组(对照组)，分别肌肉注射100略/剂的PBK-asdDNA疫苗和PVAX-asd空质粒，加强免疫2次。检测发现，从第4周至结束，PBK-asd免疫组的脾淋巴细胞增殖率，CD4+T细胞含量，抗B2L抗体和Th1细胞因子标记(IL-2,INF-γ，TNF-α)水平均显著高于对照组(P<0.05)。
(3)将15只5月龄雄性夷陵山羊随机均分为PBK-asd免疫组、PB2L-asd免疫组和PVAX-asd免疫组(对照组)。分别肌肉注射1μg/剂的PBK-asdDNA疫苗、PB2L-asd质粒和PVAX-asd空质粒，随后加强免疫2次。检测发现，PBK-asd和PB2L-asd疫苗诱导产生了抗B2L抗体和Th1细胞因子标记(IL-2，INF-γ，TNF-α)，并且从第8周开始，PBK-asd免疫组的抗B2L抗体应答水平始终显著高于PB2L-asd免疫组(P<0.05)。
(4)本研究将36只8周龄的SD雄性大鼠随机均分为PBK-asd免疫组、PVAX-asd免疫组(对照组)和手术去势组，按前述方法免疫。结果显示，PBK-asd免疫刺激了抗kisspeptin抗体应答(P<0.05)，血清中睾酮和黄体生成素(LH)的浓度显著降低(P<0.05)。而手术去势组血清LH水平显著高于对照组(P<0.05)。本研究构建的重组PBK-asdDNA疫苗显著抑制了大鼠的睾丸生长和精子发生，表现出了明显的去势效果。
(5)将15只5月龄夷陵公山羊随机均分为PBK-asd免疫去势组、PVAX-asd免疫组(对照组)、手术去势组，按前述方法免疫。结果显示，PBK-asd免疫组的血清的抗kisspeptin抗体含量显著升高(P<0.05)，血清的促卵泡激素(FSH)、LH和睾酮水平显著降低(P<0.05)，并且睾丸发育、精子发生和性行为也明显受到抑制。PBK-asd免疫去势组和手术去势组的下丘脑中KISS1基因表达水平显著升高(P<0.05)PBK-asd免疫抑制了下丘脑雄激素受体(AR)、G蛋白偶联受体(GPR54)、促性腺激素释放激素(GnRH)，垂体促性腺激素释放激素受体(GnRHR)、促卵泡素(FSH6)、促黄体素(LHb)，以及睾丸的促卵泡素受体(FSHR)和促黄体素受体(ZHR)的表达；与之相反地，在手术去势组，除AR外的其他上述基因的表达均显著上调(P<0.05)。
(6)将15只5月龄雄性夷陵山羊随机分为PBK-asd免疫去势组、PVAX-asd免疫组(对照组)和手术去势组，每组各5头，按前述方法免疫。结果表明，接种PBK-asd疫苗的山羊的生长激素水平、体重、平均日增重(ADG)和胴体重与对照组相比无显著差异(P<0.05)，而手术去势组的体重、ADG和胴体重显著低于PBK-asd免疫组和对照组(P<0.05)。三种处理间的山羊胴体性状(屠宰率、眼肌面积、脂肪厚度)和肉质性状(pH、肉色、蒸煮损失、滴水损失、剪切力)无显著差异。此外，没有检测到PBK-asd质粒与宿主基因组整合的情况，说明接种了PBK-asd疫苗的山羊肉是安全的、可食用的。
(7)PB2L-asd和PBK-asd疫苗均能引起针对Orf病毒被膜蛋白(B2L)的体液免疫和细胞免疫应答。PBK-asdDNA疫苗通过在体内产生抗kisspeptin抗体中和内源的kisspeptin,从而破坏正常的下丘脑-垂体-睾丸信号通路，实现免疫去势。此外，本研究结果表明，PBK-asdDNA疫苗是安全的，不会影响山羊的肉质和胴体性状。综上所述，本研究研发的重组B2L和Kisspeptin-54的DNA疫苗是一种有前景的，具备免疫ORFV和山羊免疫去势功能的二价疫苗。