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恶性肿瘤的免疫治疗策略已经成为手术、放疗和化疗等传统方法之外的另一种标准治疗方案。其中,肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes, CTL)过继治疗法一直是肿瘤免疫治疗研究领域的热点之一。将肿瘤特异性CTL体外培养和扩增后输注体内治疗肿瘤的模式已经在临床治疗中展开应用。但是肿瘤特异性CTL在体内的生物活性一直是直接影响其疗效的关键因素。肿瘤微环境是影响肿瘤特异性CTL在体内生物活性的重要原因之一。肿瘤免疫抑制微环境使过继的CTL难以到达肿瘤局部或者使过继的CTL活性减弱甚至无能。干扰素诱生蛋白-10(Interferon-inducible protein-10,IP-10)不仅可以定向募集T淋巴细胞到达肿瘤局部并促进其活化和增殖,而且具有抗肿瘤血管作用,改善肿瘤免疫抑制微环境,从而显示出增强过继T细胞抗肿瘤潜力。另一方面,T细胞表面高表达CD28分子可增强肿瘤特异性CD8+T细胞在体内生物活性,所以体外诱导出肿瘤特异性CD8+CD28+T细胞进行过继治疗对增强过继T细胞在肿瘤机体内细胞毒活性具有重要意义。因此,本研究研制负载mIP-10基因叶酸偶联的壳聚糖纳米粒子和采用新的诱导系统获得肿瘤特异性CD8+CD28+T细胞进行联合治疗肿瘤。研究结果表明负载mIP-10基因叶酸偶联的壳聚糖纳米粒子可以有效增强肿瘤特异性CD8+CD28+T细胞治疗肿瘤的效果。我们的研究为提高肿瘤特异性CTL在体内的活性提供了新的思路,为肿瘤过继疗法研究领域带来新的突破。本课题主要研究内容及结果如下：1.负载mIP-10基因叶酸偶联的壳聚糖纳米粒子的研制及其治疗肿瘤研究背景：趋化因子IP-10有强大的抗肿瘤作用,能趋化CTL到肿瘤局部、活化T淋巴细胞、抑制肿瘤局部新生血管生成,成为肿瘤免疫治疗靶点之一。探索新的方法使IP-10有效靶向肿瘤局部对提高IP-10发挥抗肿瘤作用具有重要意义。目的：研制负载mIP-10基因叶酸偶联的壳聚糖纳米粒子进行抗肿瘤作用及机制研究。方法：采用离子模板法和纳米技术以及化学修饰方法研制负载mIP-10基因叶酸偶联的壳聚糖纳米粒子FA-CS-mIP-10。通过X-射线、傅立叶红外光谱分析粒子构建情况：扫描电镜观察粒子大小形态;粒径仪检测粒子粒径大小；凝胶阻滞实验鉴定粒子成功负载mIP-10。进一步体外细胞吞噬实验验证FA-CS-mIP-10靶向肿瘤细胞情况。最后采用肝癌小鼠动物模型实验体内研究FA-CS-mIP-10抗肿瘤作用及机制。结果：成功研制出负载mIP-10基因叶酸偶联的壳聚糖纳米粒子FA-CS-mIP-10。该粒子在体内体外均能有效靶向肿瘤细胞,在肝癌小鼠体内有明显的抗肿瘤生长作用并延长荷瘤小鼠生存期,并进一步明确了该粒子通过抑制调节性T细胞,刺激体内肿瘤特异性T细胞IFN-Y分泌增多,抑制肿瘤血管生成,抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡等机制来达到抗肿瘤作用。结论：研制的负载mIP-10基因叶酸偶联的壳聚糖纳米粒子FA-CS-mIP-10能有效抗肿瘤。2.人工抗原递呈细胞联合IL-21和IL-15有效诱导黑色素瘤特异杀伤活性CD8+CD28+T淋巴细胞背景：T细胞表面高表达CD28分子可增强肿瘤特异性CD8+T细胞在体内生物活性。探索新的方法诱导肿瘤特异性CD8+CD28+T细胞进行过继治疗肿瘤是值得研究的课题。目的：探索人工抗原递呈细胞联合IL-21和IL-15在体外诱导黑色素瘤特异杀伤活性CD8+CD28+T淋巴细胞。方法：在细胞大小的磁珠上吸附抗CD28单克隆抗体和H-2Kb:Ig-TRP2二聚体,得到人工抗原提呈细胞(artificial antigen-presenting cell, aAPC) H-2Kb:Ig-TRP2-aAPC,同时联合低剂量小鼠IL-21和IL-15与小鼠脾脏淋巴细胞混合培养。二聚体染色法检测诱导的黑色素瘤TRP2特异性CD8+CD28+T淋巴细胞的频率,CFSE法检测诱导后T细胞增殖情况,ELISPOT法检测诱导后特异性T细胞分泌IFN-γ斑点数,最后通过PKH26/PI染色法检测TRP2特异性CD8+CD28+T细胞的特异性杀伤靶细胞活性。结果：人工抗原递呈细胞联合IL-21和IL-15在体外成功诱导出黑色素瘤TRP2特异性CD8+CD28+T淋巴细胞,具有较强的增殖能力和分泌高的IFN-γ的能力,并对小鼠黑色素瘤细胞有特异性杀伤活性。结论：人工抗原递呈细胞联合IL-21和IL-15在体外能成功诱导出黑色素瘤TRP2特异性CD8+CD28+T淋巴细胞。3.负载mIP-10基因叶酸偶联的壳聚糖纳米粒子提高肿瘤特异性CD8+CD28+T细胞抗肿瘤作用及其机制研究背景：肿瘤特异性CTL过继治疗法一直是肿瘤免疫治疗研究领域的热点之一。提高肿瘤特异性CTL在体内的生物活性一直是CTL过继疗法研究领域亟待解决的问题。目的：将研制的FA-CS-mIP-10和肿瘤特异性CD8+CD28+T细胞进行联合治疗肿瘤,并探索其作用机制。方法：建立C57BL/6小鼠黑色素瘤模型,将制备好的FA-CS-mIP-10通过尾静脉注射到荷瘤小鼠体内以及将TRP2特异性CD8+CD28+T细胞腹腔注射到荷瘤小鼠体内,观察小鼠肿瘤体积生长和生存时间并研究抗肿瘤作用机制。结果：FA-CS-mIP-10协同TRP2特异性CD8+CD28+T细胞治疗小鼠黑色素瘤能有效抑制皮下肿瘤生长,延长黑色素瘤小鼠生存时间,降低机体内和肿瘤局部免疫抑制因子MDSC和Treg,抑制血管生成,抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡。结论：FA-CS-mIP-10能有效增强肿瘤特异性CD8+CD28+T细胞治疗肿瘤的效果。