研究目的针对红色毛癣菌(Trichophyton runbrum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii)和巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)四种临床致病真菌,建立基于Taqman探针荧光定量PCR技术的快速检测方法,并对临床分离株进行应用性验证。研究意义随着广谱抗生素、皮质类固醇激素以及免疫抑制剂的使用率逐年上升,致病真菌的感染率不断提高,使真菌感染成为许多常见病和并发症的诱因之一。红色毛癣菌是临床上最为常见的皮肤癣菌,也是导致浅部真菌感染的主要病原体。临床上约80%体股癣及72%手足癣及甲癣由红色毛癣菌引起。在引起人类真菌性角膜炎的常见致病真菌中,镰刀菌最多,占62%。卡氏肺孢子菌是一种机会性感染病原体,多见于免疫机制缺陷者,导致卡氏肺孢子菌肺炎的发生,患者若不经治疗病死率达100%。巴西副球孢子菌可引起皮肤粘膜,淋巴结和内脏器官感染的慢性化脓性肉芽肿性疾病。可经呼吸道、消化道以及皮肤黏膜损伤处进入人体引起感染,艾滋病患者发病率极高。目前我国临床致病真菌的检测主要依赖形态学观察,但仍存在阳性检出率低,以及阳性率和准确率因取材部位和取材量不同易出现假阴性结果。真菌培养仍然是诊断的金标准,这类诊断方法存在耗时较长、检出率低等不足。通过真菌培养法鉴定临床致病真菌至少需要2-7天,至2周后仍没有菌体生长才可确定为阴性结果,在一定程度上延误了早期诊断和治疗。我国尚缺乏一种快速、准确、稳定的检测致病真菌的方法以满足临床快速诊断的需要。因此,逐步开展临床致病真菌检测的研究对于我国临床上致病真菌的快速诊断及早期针对性的用药具有深刻的指导意义。研究方法本研究运用Bioeidt和Beacon Designer等生物学软件,分别设计了四组特异性的引物和探针,建立了红色毛癣菌、尖孢镰刀菌、卡氏肺孢子菌和巴西副球孢子菌的荧光定量PCR检测方法,并通过制备各种真菌的质粒DNA标准品,对致病真菌进行准确定量；同时评估该方法的特异性、灵敏度、重复性。最后利用建立的四种致病真菌检测方法对北京大学真菌与真菌病研究中心、陕西省眼科研究所、山东省眼科研究所以及本研究中保存的共115株致病真菌标准株和临床分离株进行验证。研究成果本研究分别建立了基于Taqman探针荧光定量PCR技术的红色毛癣菌、尖孢镰刀菌、卡氏肺孢子菌和巴西副球孢子菌快速检测方法。这些方法通过1-2天内培养出足够进行荧光定量PCR检测的真菌菌体,再通过菌体收集、DNA提取以及进行定量PCR反应,仅需2-3天。与传统的真菌培养法相比,不仅明显缩短了真菌检测的时间,特异性高,均为100%；灵敏度高,前两者灵敏度为102copies/μl,而后两者灵敏度达到101copies/μl；重复性好。应用该方法对临床分离株的检测,准确率也达到100%。研究结论本研究建立的检测红色毛癣菌、尖孢镰刀菌、卡氏肺孢子菌以及巴西副球孢子菌的Taqman探针荧光定量PCR方法,不仅快速简单,而且准确特异,灵敏度高且重复性好,将为临床致病真菌的检测打下基础。