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微（纳米）塑料由于其特殊的性质如小粒径、高表面活性以及降解困难等,给生态环境和人类的生命健康带来潜在的危害,已经作为一类新型环境污染物受到科研人员的高度关注。目前大量研究报道了微（纳米）塑料在水生生物体内的累积以及毒性作用。此外,已经证明工程纳米材料（ENMs）进入生物体内接触生理环境后,会迅速吸附体液中的蛋白质等大分子物质形成“蛋白冠”。这不仅改变了ENMs固有的表面性质,而且会进一步影响其后续的生物学效应。然而,目前关于塑料颗粒介导的蛋白冠效应研究较少,尤其是从纳米塑料的纳米特性角度进行分析。因此,迫切需要开展相关的工作。暴露在自然环境中的塑料受到外界因素如紫外照射、风化、机械应力以及空气中氧气等作用发生老化。而老化可以显著影响塑料的物理化学性质,使其表现出与原始塑料不同的表面特性。因此在研究微（纳米）塑料的环境行为及生物学效应时,老化带来的相关影响也不容忽视。第一部分:聚苯乙烯是生产和生活中应用最普遍的商用塑料之一,因此本实验选用聚苯乙烯纳米塑料（PS NPs）为纳米塑料模型,分析了其与胎牛血清（FBS）蛋白的相互作用以及随后对小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7）的毒性效应的影响。首先分析了PS NPs与FBS的相互作用。SDS-PAGE及LC-MS/MS检测结果发现,PS NPs与FBS孵育后,可以吸附FBS中不同分子量以及不同种类的蛋白质形成蛋白冠,并且其相互作用是与浓度和时间相关的动态过程。TEM结果进一步观察到FBS蛋白包裹在PS NPs表面,形成了厚度为46 nm的蛋白冠层。接下来分析了蛋白冠的形成对PS NPs细胞毒性的影响。通过CCK-8方法对细胞的存活率进行分析,结果显示PS NPs以浓度依赖性的方式降低RAW264.7细胞的存活率。而与裸露的PS NPs相比,相同浓度PS@FBS复合物处理后,细胞存活率从72.7%升高至88.2%,PI阳性细胞百分比从26.4%降低至12.4%以及LDH释放也相对减少。由此说明FBS蛋白的吸附显著降低了PS NPs导致的细胞毒性。接下来通过WB实验检测了PS NPs作用后RAW264.7细胞中自噬相关蛋白的表达水平,发现LC3B-Ⅱ及P62蛋白的表达呈现时间和浓度依赖性上调。进一步转染GPF-LC3绿色荧光蛋白对自噬小体进行标记也观察到PS NPs处理后细胞内GFP-LC3荧光亮点数量随时间增加,说明PS NPs的处理引起细胞内自噬小体的累积。而与裸露的PS NPs相比,PS@FBS复合物处理后显著降低了细胞内LC3B-Ⅱ以及P62蛋白的表达水平以及细胞中的GFP-LC3荧光亮点数量以及净自噬流水平的阻断。说明FBS蛋白的吸附缓解了PS NPs引起的自噬流阻断以及自噬小体累积。接下来评估了材料在细胞内的定位,结果显示,PS NPs以及PS@FBS复合物均与溶酶体共同定位。但是,裸露PS NPs与溶酶体的同定位比PS@FBS复合物多。进一步对溶酶体的结构和功能进行检测,发现PS NPs的处理造成细胞溶酶体膜的通透性增大、组织蛋白酶B的泄漏、溶酶体pH升高以及酸性磷酸酶活性的降低,而FBS的包裹则缓解了PS NPs引起的溶酶体功能障碍。另外,通过对细胞的氧化应激相关指标进行检测,评估了氧化应激在PS NPs及PS@FBS复合物引起的细胞毒性中的作用。类似的,FBS的吸附缓解了裸露PS NPs导致的细胞内ROS水平的升高、G-PX活力的降低及GSH的消耗。而抗氧化剂VE的加入导致PS NPs及PS@FBS复合物引起的AOlow细胞百分比及PI阳性细胞百分比均部分降低。说明氧化应激部分参与PS NPs及PS@FBS复合物引起的细胞损伤。通过流式细胞仪以及超分辨激光共聚焦显微镜检测了细胞对材料的摄取,结果显示细胞对PS@FBS复合物的摄取量比PS NPs少。以上实验结果表明,PS NPs可以吸附FBS中不同分子量及不同种类的蛋白质形成蛋白冠,并且蛋白冠的形成降低了PS NPs造成的细胞毒性、自噬流的阻断、溶酶体功能损伤以及氧化应激水平,并且这种细胞毒性及损伤的降低可能与其减少的摄取有关。第二部分:该部分旨在探究蛋白冠层随着PS NPs的摄取以及在RAW264.7细胞内运输过程中发生的演变。在本章中,我们选用FBS中丰度较大同时也是PS NPs表面吸附较多的牛血清白蛋白（BSA）进行后续实验。首先将PS NPs和BSA在体外孵育后,通过SDS-PAGE及银染实验验证了BSA在PS NPs表面的吸附。然后通过流式细胞仪以及超分辨激光共聚焦显微镜分析了细胞对材料的摄取,结果显示PS NPs及PS@BSA复合物均能够被RAW264.7细胞摄取且摄取能力无明显差异。接下来使用活细胞工作站以及超分辨激光共聚焦显微镜分析了蛋白冠在细胞内的演变,结果显示当PS@BSA复合物被RAW264.7细胞内吞以及在细胞内运输时,BSA蛋白至少部分保留在PS NPs表面。然而,随着作用时间的延长,BSA蛋白逐渐被降解。进一步通过超分辨激光共聚焦显微镜对PS@BSA复合物在细胞内的定位进行分析,发现BSA蛋白冠层随着PS NPs进入到溶酶体中,并在溶酶体内被完全降解。为了探究BSA蛋白冠层的形成及其在溶酶体中的降解对PS NPs细胞毒性的影响,我们对相关指标进行了检测。CCK-8实验对RAW264.7细胞存活率检测结果显示,随着BSA蛋白冠层的降解,PS@BSA复合物的细胞毒性逐渐表现出来,造成细胞存活率的降低,并且与PS NPs组的差异逐渐减小。PI实验结果表明,裸露的PS NPs快速诱导RAW264.7细胞的细胞膜损伤,2 h后便造成PI阳性细胞百分比从对照组的2.2%上升到8.7%。而PS@BSA复合物处理后10 h内,并没有观察到这种膜损伤,说明BSA冠层具有保护作用。但在12 h时PI阳性细胞百分比上升至7.4%,提示其细胞膜损伤能力的恢复。以上实验结果说明,PS@BSA复合物在被RAW264.7内吞以及在细胞内运输时,BSA蛋白至少部分保留在PS NPs表面,并在早期暴露时屏蔽了PS NPs引起的细胞膜损伤。直到其被运输进入溶酶体后,BSA蛋白冠层被降解,其毒性又逐渐表现出来。第三部分:该部分旨在探究老化作用对PS NPs的生物学效应以及蛋白质吸附行为的影响。我们通过紫外照射人为加速了PS NPs的老化进程制备得到老化后的聚苯乙烯纳米塑料（Aged PS NPs）并对其进行表征。FTIR光谱分析结果显示,与PS NPs相比,在Aged PS NPs的FTIR光谱中观察到增强的-OH以及C=O的伸缩振动特征峰。说明经过紫外照射后,PS NPs发生了表面氧化。并且与原始PS NPs相比,Aged PS NPs的水合粒径及Zeta电位显著降低。以上实验结果说明老化显著改变了PS NPs的物理化学性质。为了考察老化作用对PS NPs造成的细胞损伤的影响,我们将PS NPs及Aged PS NPs作用于RAW264.7细胞后,对相关指标进行了检测。自噬相关蛋白的WB检测结果发现与原始PS NPs相比,Aged PS NPs的处理降低了细胞中LC3B-Ⅱ以及P62蛋白的表达,降低了RAW264.7细胞内自噬小体的累积。此外,Aged PS NPs作用于细胞后,AOlow细胞百分比相对于原始PS NPs显著减少（从63.5%降低至16.6%）,说明老化后的PS NPs对细胞的溶酶体损伤较小。同样的,PI染色实验结果也显示与原始PS NPs相比,Aged PS NPs的处理明显降低了PI阳性细胞百分比（26.5%减少至11.3%）,说明老化后PS NPs对RAW264.7的细胞膜损伤降低。进一步探究老化作用会对PS NPs的蛋白吸附特性的影响。SDS-PAGE及银染实验结果发现,PS NPs及Aged PS NPs都可以吸附FBS中不同分子量的蛋白质形成蛋白冠,并且吸附的蛋白在分子量上没有看到明显差异。通过分别改变FBS的浓度和作用时间后,进一步观察Aged PS NPs与FBS的相互作用。发现与原始PS NPs的吸附特性不同,随着FBS浓度的增加以及作用时间的延长,Aged PS NPs表面吸附的不同分子量的蛋白含量均逐渐增加。说明老化改变了PS NPs对FBS中特定分子量（40-80 kD）蛋白的吸附特性。以上实验结果说明,老化改变了PS NPs的物理化学性质,并且降低了PS NPs对RAW264.7细胞的损伤,同时改变了PS NPs对FBS蛋白的吸附特性。