论文部分内容阅读
三七总皂苷属于达玛烷型三萜皂苷,是我国传统名贵药材三七的主要活性成分研究表明三七总皂苷在中枢神经系统、心脑血管系统、血液系统、免疫系统以及抗纤维化、抗衰老、抗肿瘤等方面均具有较好的药理活性。随着对三七总皂苷和部分单体皂苷药理活性研究的不断深入,三七应用范围越来越广,市场需求量越来越大。三七种植对生长环境要求苛刻,病虫害严重,需要轮作,土地利用率低,难以扩大种植面积,供需矛盾日渐突出。近年来,植物次生代谢工程的基因调控已成为分子生物学研究的热点与难点,而皂苷类物质是植物次生代谢产物的重要组成部分,其含量和组成主要取决于生物合成关键酶。随着皂苷类物质生物合成途径研究的不断深入,通过代谢工程手段调控三七皂苷的生物合成逐步成为可能。本课题利用分子生物学技术研究三七中SS, DS基因在皂苷生物合成途径中的作用,为将来三七总皂苷同源或异源高效表达系统的构建提供理论依据和技术基础。首先开展三七愈伤组织的诱导和增殖研究,建立稳定的三七愈伤细胞系,为后续实验提供研究材料。结果表明,以三七子叶为外植体,MS为基本培养基,添加2.0mg/L2,4-D、1.0mg/L KT的植物激素,25℃暗培养的情况下,愈伤组织诱导率最高,可达35%,同时在此条件下愈伤组织增殖速度也最快。从三七叶中克隆得到SS、DS基因全长cDNA序列,并对SS、DS基因编码的氨基酸序列进行同源性分析。结果表明,推衍的三七SS氨基酸序列与西洋参(Panax quinquefolius)、人参(Panax ginseng)、积雪草(Centella asiatica)和青蒿(Artemisia annua)的SS氨基酸序列相似性分别为99%、98%、90%、81%；推衍DS氨基酸序列与人参中DS氨基酸序列同源性为99%,与积雪草中β-香树脂醇合成酶氨基酸序列的同源性为74%。利用分子生物学技术构建SS, DS的组成型植物表达载体pCAMBIA2300S-S、pCAMBIA2300S-DS,并通过CaCl2冻融法将植物表达载体转入农杆菌菌株LBA4404和EHA105中。根癌农杆菌介导法转化三七愈伤细胞,建立基于愈伤组织的三七遗传转化体系。通过基因组DNA PCR检测获得18株转基因细胞系(SS),编号分别为TE1、TE2、TE3、TE6、TE7、 TE8、TE9、TE10、TE18、TE21、TE24、TE26、TL1、TL2、TL3、TL5、TL6、 TL7。挑选9个增殖较快的细胞系做SS表达研究,Real-time PCR结果显示,8个转基因细胞系中的SS转录水平有所增加,其中TE10SSmRNA表达量最高,是野生型细胞系的3.25倍。为明确SS在三七皂苷生物合成途径中的作用,选取4株生长速度较快的转基因细胞系,测定其三七总皂苷和单体皂苷含量。转基因细胞系TE1、TE8、TE10单体皂苷和总皂苷积累量相对野生型细胞都有所增加,而TE9单体皂苷和总皂苷含量低于野生型细胞。TE10单体皂苷含量最高,约为野生型细胞的2.59倍,而TE8总皂苷含量最高,约为野生型细胞的1.27倍。研究结果初步表明SS转录水平的提高有利于皂苷的积累,说明SS在三七皂苷生物合成中起着重要调控作用。