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氯乙基亚硝基脲(CENUs)是临床上一类重要的抗癌药，广泛应用于黑色素瘤、白血病、霍奇金淋巴瘤、脑瘤和多种实体瘤的治疗。由于其能穿透血脑屏障，因此对脑瘤的治疗十分有效。CENUs主要通过对DNA的双官能团烷化作用，诱导DNA互补碱基对产生dG-dC股间横向交联，抑制DNA复制与转录等生化代谢过程，从而杀死癌细胞，发挥抗癌作用。然而，肿瘤细胞对CENUs的耐药性限制了其在临床化疗中的进一步应用。流行病学研究表明，O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)是肿瘤细胞对CENUs产生耐药性的重要原因之一。MGMT是细胞内一种独特的DNA修复酶，它能将烷化剂对DNA鸟嘌呤O6位造成的烷化损伤转移到自身活性中心Cys145残基上，从而修复DNA。在临床上，CENUs的化疗效果通常与肿瘤组织中MGMT的表达水平呈负相关性，即高水平MGMT会导致肿瘤细胞对CENUs化疗产生耐药性。因此，抑制肿瘤细胞中MGMT的活性成为临床上提高CENUs化疗效果的关键策略之一。为克服肿瘤细胞的耐药性，提高CENUs的化疗效果，本论文以肿瘤细胞对CENUs的耐药性为出发点，应用了多种理论和实验方法深入研究了MGMT与CENUs耐药性的相互关系。 第一，从DNA加合物水平上进一步阐明了CENUs的耐药性机理。利用稳定同位素稀释高效液相色谱电喷雾串联质谱联用(HPLC-ESI-MS/MS)法研究了MGMT抑制剂O6-苄基鸟嘌呤(O6-BG)与尼莫司汀(ACNU)联合处理人脑神经胶质瘤SF767细胞(MGMT高表达)后细胞中dG-dC股间交联水平的变化情况。结果表明ACNU/O6-BG联合处理组(403～1952fmol/mg DNA)的dG-dC股间交联水平显著高于ACNU单独处理组(307～1276fmol/mg DNA)。在相同条件下，细胞毒性实验的结果与交联结果趋势相同。在经皮尔逊相关性检验后发现dG-dC交联水平与细胞死亡率显著相关(R=0.85，P＜0.01)，表明dG-dC可作为评价MGMT抑制剂与CENUs联合化疗效应的生物标志物。由于之前的方法只能检测细胞中总的DNA股间交联，而不能特异性检测dG-dC交联。因此，本研究证实了O6-BG作为MGMT抑制剂，可抑制MGMT对dG-dC股间交联的前体O6-氯乙基脱氧鸟苷(O6-C1EtdG)和N1，O6-桥亚乙基脱氧鸟苷(N1，O6-EtdG)修复，从而提高CENUs诱导的dG-dC的形成，克服肿瘤细胞对CENUs产生的耐药性。 第二，利用HPLC-ESI-MS/MS建立了一种新型的MGMT活性检测方法。与之前的放射性转移法、荧光法和ELISA方法相比，本方法具有准确性高、灵敏度高和非放射性等优点。基于O6-BG与MGMT的高亲和力，以O6-BG为MGMT的底物，D6-O6-BG为同位素内标，通过检测反应体系中O6-BG的变化情况，计算出MGMT的活性，结果以fmol/mg protein表示。实验测定了8种人类肿瘤细胞（神经胶质瘤SF126、SF767和SF763细胞，肝癌HepG2和SMMC-7721细胞，宫颈癌HeLa细胞，肺癌A549细胞和乳腺癌MCF-7细胞）中MGMT的活性，同时用Westem blot方法对8种细胞中MGMT的表达水平进行了检测，以验证本研究建立的MGMT活性检测方法的可靠性。结果表明MGMT的活性在不同细胞中差异较大(0～1021fmol/mg protein extracts)，具体顺序为SF763＞SMMC-7721≥MCF-7＞HeLa＞SF767＞A549＞HepG2＞SF126，这也表明在临床上建立有效的MGMT活性测定方法对于化疗应用以及流行病学癌症风险筛查具有重要意义。 第三，建立了鸟嘌呤衍生物作为MGMT抑制剂的3D-QSAR模型并进行了分子对接研究。利用三种叠合方法对配体分子进行叠合，通过模型内部验证、外部验证和Y-随机化验证后得出基于配体叠合方法的CoMFA模型为最优的3D-QSAR模型。3D等值图分析和分子对接研究揭示了鸟嘌呤衍生物作为MGMT抑制剂的结构修饰信息。其中，鸟嘌呤C2位的-NH2和C6位的O原子是抑制剂发挥活性的必要因素。由于空间位阻效应，在鸟嘌呤N7位引入取代基会降低化合物的抑制活性，而在C8位只能引入体积较小的取代基;相反，鸟嘌呤N9位则对取代基相对耐受，引入取代基后对活性影响不大。此外，在O6-BG及其衍生物苄基苯环的间位和对位进行取代会增加化合物的活性，邻位取代一般会导致空间位阻效应，降低化合物的活性。该部分研究对鸟嘌呤衍生物作为MGMT抑制剂的作用机理进行了详细的阐明，同时为设计新型、高活性的MGMT抑制剂提供重要的理论依据。 第四，在本论文前述研究的基础上设计并合成了一种新型的抗耐药性联合亚硝基脲，并对其抗肿瘤活性和作用机理进行了研究。在生理条件下，该化合物可以分解产生氯乙基重氮氢氧化物作为DNA股间交联剂，同时产生O6-[(3-异氰酸)苄基]鸟嘌呤甲酯(106)及其水解产物O6-[(3-氨甲基)苄基]鸟嘌呤(48)作为MGMT抑制剂。其中，106和48可抑制MGMT对dG-dC交联前体的修复，提高氯乙基重氮氢氧化物诱导的dG-dC交联水平，因此能克服肿瘤细胞产生的耐药性。细胞毒性实验表明在MGMT高表达的SF767和SF763细胞中，与ACNU和BCNU单独处理组以及ACNU/O6-BG和BCNU/O6-BG联合处理组相比，该化合物表现出较高的细胞毒性效应(IC50值分别为25μM和35μM)，且能诱导SF763细胞产生高水平的dG-dC股间交联。分子对接研究也从理论上支持了上述实验结果。因此，该部分研究为设计新型高效低毒的抗耐药性联合亚硝基脲提供了理论和实验基础。 综上所述，本论文从CENUs的耐药性机理、耐药性MGMT蛋白活性测定、MGMT抑制剂的作用机理以及抗耐药性联合亚硝基脲的合成、活性评价与作用机理几个方面，对肿瘤细胞中MGMT介导的CENUs耐药性及其抑制作用做了一系列相关研究，为设计靶向性MGMT抑制剂以及新型抗耐药性联合亚硝基脲提供了重要的理论依据和实验指导。