论文部分内容阅读
烟草加工产生的废弃物中含有大量的尼古丁,会对环境以及人类健康造成严重危害。恶臭假单胞菌S16可采用吡咯途径高效地代谢尼古丁。本论文深入系统地探索了菌株S16代谢尼古丁途径中的第一步关键酶NicA2以及转录调控蛋白NicR2的结构和功能。NicA2是恶臭假单胞菌S16代谢尼古丁途径中的第一步关键酶,催化尼古丁脱氢生成假氧化尼古丁(pseudooxynicotine,PN)。我们获得了NicA2自身以及NicA2与底物尼古丁复合物的晶体结构。通过结构分析,我们发现:与节杆菌中结构已解析的类似功能蛋白相比,NicA2蛋白中缺少脂链,但对产物释放出口的包裹更加紧密。催化底物的活性口袋深埋于蛋白内,大型的惰性氨基酸又阻挡了产物释放的通道,这导致PN释放非常缓慢,与实验证明的FAD依赖的快速脱氢反应相矛盾。将阻挡产物释放的大侧链氨基酸突变为小侧链氨基酸,明显加快了PN释放速度并带来PN的累积,但同时严重抑制了菌体的正常生长;过表达代谢PN的酶Pnao则可以挽救PN积累带来的生长颓势。关于NicA2结构特点的分析连同功能实验的验证,证明了NicA2行使“分子减速器”的功能,将有害代谢中间产物PN缓慢释放进而降低其对菌体的伤害。NicA2隶属于FAD依赖的单胺氧化酶家族,人源单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAOA、MAOB)催化神经递质并与神经失调类疾病,如抑郁症、帕金森病等关系密切。我们发现,NicA2不仅与细菌来源的单胺氧化酶具有序列相似性,而且与人源MAOA、MAOB的结构也具有较大相似性。NicA2与MAOA、MAOB都具有“洞穴”类催化活性口袋,将底物包裹。阻碍NicA2产物释放通道的氨基酸与MAOA、MAOB的氨基酸序列有一定的相似性,针对MAOA产物释放通道中的大侧链氨基酸的突变可加快其对产物的释放;针对MAOB进行的计算机模拟也证明将产物释放通道内的大型氨基酸突变能有效降低产物释放消耗的能量。故而,我们推测人源单胺氧化酶同样具有“分子减速器”功能,精确控制产物的释放从而调节人体神经类物质的平衡。基于单胺氧化酶家族蛋白催化产物为含氮化合物,而含氮化合物常对细胞具有较强的毒性,故而不能在细胞内过量累积,所以我们推测,单胺氧化酶可能普遍存在“分子减速器”的作用机制,从而将胞内含氮化合物的浓度维持在一个较低的水平。负责恶臭假单胞菌S16分解尼古丁后半程代谢途径的nic2基因簇受到TetR转录调控蛋白家族的成员—NicR2的调控。我们获得了NicR2自身及NicR2与效应物6-羟基-3-琥珀酰吡啶(6-hydroxy-3-succinoyl-pyridine,HSP)复合物的晶体结构。结构揭示:NicR2由一个DNA结合结构域和一个效应物结合结构域组成。HSP结合在NicR2蛋白表面呈弱正电性的凹陷中,等温量热滴定实验证实了参与效应物的结合的残基的重要性。NicR2底物结合口袋与HSP的适配性以及HSP与其他代谢中间产物结构上的差异导致NicR2选择性地识别HSP作为效应物。我们通过结构相似性分析,找到了NicR2直接参与DNA结合的氨基酸,并通过等温量热滴定实验定量证实。此外,我们还发现NicR2的N端延长也参与结合DNA。基于结构,我们推测NicR2蛋白和DNA一定会发生结构上的改变来适应彼此的结合。结构和生化功能研究揭示了NicR2如何选择性识别效应物和DNA,增添并丰富了人们对TetR家族的认知。综上所述,本论文综合运用微生物学、结构生物学、生物化学以及生物信息学工具,深入挖掘和探索了恶臭假单胞菌S16代谢尼古丁途径中的关键氧化还原酶NicA2和关键调控蛋白NicR2结构和功能,丰富了人们对假单胞菌降解尼古丁分子机制、调控机制的认知,延伸了微生物来源的蛋白与同源的人类家族蛋白的关联,为相关的生物学研究和酶学定向改造提供了坚实的理论基础。