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肌腱老化是一个不可避免的生理过程,常伴随肌腱结构和功能特性的下降,是导致老年人运动系统慢性疼痛、活动受限、肌腱断裂的主要原因之一。肌腱组织内除包含终末分化的肌腱细胞外,还存在一类干细胞群体,称为肌腱干细胞(tendon stem/progenitor cells,TSPCs)。TSPCs在肌腱修复、再生和内稳态维持中起着重要作用。研究表明,TSPCs的衰老与老年相关性肌腱疾病密切相关。与年轻细胞相比,老年TSPCs表现出严重的自我更新、迁移和成肌腱分化缺陷,并伴有转录组的异常改变,导致肌腱愈合和再生能力受损。虽然TSPCs在衰老过程中的功能失调已得到广泛认同,但其具体分子机制仍不清楚。Wnt5a是一种典型的非经典Wnt信号通路配体,在干细胞的衰老和调控中起着重要作用。但目前还没有关于Wnt5a在TSPCs衰老中的作用及机制研究。本研究中,我们旨在确定非经典Wnt5a在TSPCs衰老、衰老相关分泌表型(SASP)和老年相关功能失调中的特殊作用,并进一步探讨其调控TSPCs衰老的具体机制。本研究中,我们建立了小鼠自然衰老模型,分别从2月龄和20月龄的雄性C57BL/6小鼠提取TSPCs。通过免疫荧光,q RT-PCR和western blotting检测Wnt5a的时空表达。而后使用Wnt5a sh RNA或Wnt5a重组蛋白处理TSPCs,使用转录组学分析,β-gal染色,western blotting,q RT-PCR,免疫荧光和细胞周期分析来确认Wnt5a在TSPCs衰老或SASP中的作用。通过克隆形成实验,CCK-8和PDT分析证明Wnt5a在TSPCs自我更新中的作用。通过划痕实验和肌动蛋白动力学分析研究Wnt5a在TSPCs迁移中的作用。通过q RT-PCR检测Wnt5a在TSPCs成肌腱分化中的作用。此外,通过GSEA KEGG PATHYWAY分析,q RT-PCR和western blotting探索Wnt5a调控TSPCs衰老的具体分子机制。实验采用非配对t检验和方差分析进行统计学比较,显著性设为P<0.05。所有数据均以平均值±标准误表示。第一部分中,H&E染色结果提示,相对于年轻小鼠,老年小鼠来源的跟腱组织其胶原纤维排列不规则,胶原稳定性丧失。茜素红染色显示老年小鼠来源的跟腱组织出现明显钙化灶。番红-O染色结果显示老年跟腱组织内蛋白多糖的含量出现下降。克隆形成实验提示TSPCs具有较强的克隆形成能力。TSPCs表达间充质干细胞标志物(CD73和CD105),成纤维细胞标志物(CD90.2),但造血干细胞标志物(CD34)表达呈阴性。TSPCs还具有成骨、成脂肪、成软骨分化能力。此外,转录组分析提示TSPCs发生衰老后转录组发生显著变化。基因本体(Gene Ontology,GO)分析发现差异基因在增殖、迁移、细胞活力、分泌、肌动蛋白细胞骨架、干细胞分化相关功能基因簇中显著富集。GSEA KEGG PATHYWAY分析提示JAK-STAT信号通路可能在TSPCs衰老中发挥重要作用。第二部分中,通过对Wnt家族成员的表达谱进行分析,我们发现Wnt5a的表达显著增加,而其他经典Wnt家族成员在TSPCs衰老过程中的表达没有显著变化。通过q RT-PCR和western blotting证实了Wnt5a m RNA在在老年TSPCs中的表达显著增加。Wnt5a重组蛋白处理降低了年轻TSPCs中β-catenin的表达,表明Wnt5a对TSPCs中β-catenin的表达有直接作用。Wnt5a重组蛋白处理也减少了经典Wnt信号通路下游靶基因Axin2和Lgr5的表达。此外,Wnt5a sh RNA转染可显著降低老年TSPCs中β-gal阳性衰老细胞的数量,这与衰老标志物p16INK4A的显著抑制有关。细胞周期分析表明,沉默Wnt5a可逆转老年TSPCs的G1期阻滞。免疫荧光染色显示,Wnt5a sh RNA处理显著增加了老年TSPCs中极化细胞的比例。相反,Wnt5a重组蛋白处理促进了年轻TSPCs细胞衰老表型的发生。此外,Wnt5a sh RNA转染可逆转老年TSPCs中SASP相关基因(IL6、IL16、Cxcl1、Cxcl5、Cxcl12、Ereg、Tnfsf11、Ccl2)表达的升高趋势。克隆形成实验表明Wnt5a sh RNA可显著增加老年TSPCs的克隆形成能力。PDT和CCK-8检测显示敲低Wnt5a可提高老年TSPCs的增殖潜能。划痕实验结果显示老年TSPCs的迁移速度和距离均比小于年轻TSPCs,而抑制Wnt5a改善了老年TSPCs的迁移缺陷。敲低Wnt5a还改善了老年TSPCs的肌动蛋白转换能力。最后,抑制Wnt5a表达可逆转老年TSPCs中肌腱相关标志物水平的下降趋势,包括Tnmd、Col1A1、Nestin、Scx和Bgn。第三部分中,我们使用GSEA KEGG PATHYWAY分析来识别衰老和敲低Wnt5a的衰老TSPCs中富集的信号通路。GSEA KEGG分析显示,在Wnt5a敲低的老年TSPCs中,JAK-STAT信号通路相关基因的富集度显著降低。Western blotting结果表明,老年TSPCs中p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平显著升高,表明JAK-STAT信号通路的异常激活,而敲低Wnt5a可抑制JAK2和STAT3的磷酸化。而经IFN-γ处理则可减弱Wnt5a sh RNA对JAK-STAT信号通路和TSPCs衰老的抑制作用。此外,Wnt5a重组蛋白诱导的年轻TSPCs中p-JAK2和p-STAT3水平的增加被Ror2-si RNA废除,提示Wnt5a激活JAK-STAT信号通路依赖于Ror2。敲低Ror2还抑制了Wnt5a重组蛋白诱导的p16INK4A表达、β-gal阳性衰老细胞数目以及SASP相关基因表达的增加趋势。综上所述,我们的研究表明非经典Wnt5a的异常表达是TSPCs细胞衰老的重要因素。在功能上,抑制Wnt5a可减轻TSPCs的衰老、衰老相关的细胞极性改变和SASP相关基因的表达。敲低Wnt5a还恢复了TSPCs老年性相关自我更新、迁移和成肌腱分化功能障碍。我们进一步的研究发现Wnt5a通过一种先前未知的非经典Wnt信号通路,即Wnt5a通过增强JAK-STAT信号通路的激活来促进TSPCs衰老。此外,我们还发现Ror2在TSPCs衰老过程中充当Wnt5a的功能性受体。我们的发现提示了一种新的TSPCs衰老调控机制,其可能是治疗老年性相关肌腱病变的理想靶点。