【摘 要】
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背景卵巢癌是一种常见的妇科恶性肿瘤,死亡率居妇科恶性肿瘤之首。其发病率和死亡率较高的两大主要原因是:1)发现晚:目前现有的影像检查手段难以在发病初期及时诊断,因此很多患者被诊断时已处于晚期,失去了手术治疗的机会;2)耐药性:大部分患者对铂类药物初始治疗有效,但停止治疗后一段时间复发,间隔亦越来越短。因此,探究一种安全且行之有效的新型药物从而改善卵巢癌的诊断及治疗现状迫在眉睫。超声微泡是一类已经应用
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目,81271635,靶向CD133+肿瘤干细胞多模态分子探针的构建及其在胰腺癌诊疗中的研究； 中国国家自然科学基金（81301270）；
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背景卵巢癌是一种常见的妇科恶性肿瘤,死亡率居妇科恶性肿瘤之首。其发病率和死亡率较高的两大主要原因是:1)发现晚:目前现有的影像检查手段难以在发病初期及时诊断,因此很多患者被诊断时已处于晚期,失去了手术治疗的机会;2)耐药性:大部分患者对铂类药物初始治疗有效,但停止治疗后一段时间复发,间隔亦越来越短。因此,探究一种安全且行之有效的新型药物从而改善卵巢癌的诊断及治疗现状迫在眉睫。超声微泡是一类已经应用于临床超声诊断的超声造影剂。在超声的作用下微泡可以散射强超声信号,达到增强超声成像的目的。同时微泡也可以加强空化效应,因此在基因转染、药物传递等方面也有一些应用,然而目前的超声微泡大多为微米级,无法通过血管内皮间隙到达肿瘤组织部位,极大的限制了其应用。本研究旨在制备纳米级超声微泡CD44-NBs,以实现超声诊断与声动力治疗的有机结合。方法1)纳米超声微泡CD44-NBs的制备及表征:制备CD44-NBs纳米超声微泡;利用透射电镜及光学显微镜观察CD44-NBs纳米超声微泡的形貌及分散性;通过动态光散射系统测定其粒径分布及zeta电位;利用紫外可见光分光光度计检测姜黄素包封率及药物释放情况;体外超声辐照CD44-NBs后,观察其相变能力。2)纳米超声微泡CD44-NBs的体内外靶向性评价:首先探讨卵巢癌组织中CD44的表达与临床病理特征的关系;流式细胞仪分析卵巢癌细胞株CD44表达情况;流式细胞仪、激光共聚焦检测CD44-NBs纳米超声微泡对卵巢癌细胞株的体外靶向性;近红外活体成像检测其对卵巢癌荷瘤鼠的体内靶向性;通过体内外超声实验探究其超声成像效果。3)纳米超声微泡CD44-NBs靶向治疗卵巢癌的实验研究:通过CCK-8检测其体外安全性;通过血生化指标及病理切片检测其在体内的安全性;观察裸鼠的肿瘤生长情况、生存期分析等探究其体内治疗作用。4)纳米超声微泡CD44-NBs声动力治疗卵巢癌的杀伤机制研究:检测超声辐照CD44-NBs后活性氧的产率;通过细胞平板克隆、划痕迁移和侵袭实验探究其对卵巢癌恶性细胞生物学行为的影响;使用Western Blot和qRT-PCR检测其逆转肿瘤耐药相关机制。结果1)CD44-NBs纳米超声微泡在透射电镜下为圆形,表面较为光滑规则,分布均一,平均粒径为202.4±1.8 nm,分散性良好;姜黄素的包封率约为93.34%,载药量为8.7%,全氟己烷的包裹量约为77%;4°C放置一周,水合粒径和包封率均未发现明显改变,稳定性良好;在超声治疗仪上处理2分钟后,微泡平均直径为829.8±5.1 nm,CD44-NBs纳米微泡在超声激发后实现了纳米级向微米级的转变;使用紫外可见光分光光度计测得,随着超声处理时间的延长,材料中的姜黄素会被不断释放出来。2)探讨卵巢癌组织中CD44的表达与临床病理特征的关系发现:有腹水及淋巴转移的患者组织CD44的表达率更高;FIGO分期越高,CD44表达越强;流式细胞仪分析卵巢癌细胞株CD44表达情况:SKOV3细胞CD44表达高达99%,而ES-2细胞CD44表达为20%左右;流式细胞仪、激光共聚焦检测显示CD44-NBs纳米超声微泡对CD44阳性卵巢癌细胞株有较好的靶向性;近红外活体成像证实CD44-NBs纳米超声微泡可以更久地聚集在肿瘤组织中;体内外超声成像实验显示:相比脱气水的无回声信号,CD44-NBs纳米超声微泡在超声激发后显示为强回声信号,可以进行超声成像。3)纳米超声微泡CD44-NBs体内外安全性评价和治疗实验可以发现:在体外浓度达到100μg/m L时,CD44-NBs纳米超声微泡仍具有较好的细胞安全性;对荷瘤小鼠的主要脏器无明显损伤,血生化指标无明显异常,未对裸鼠自身产生其它毒副作用;CCK-8测得CD44-NBs+US组细胞存活率最低为10.45±5.8%,有较好的体外杀伤作用;体内通过观察小鼠瘤体变化、生存期以及肿瘤免疫组化发现CD44-NBs联合声动力治疗有较好的抑瘤效果。4)CD44-NBs纳米超声微泡在进行超声处理后活性氧的产率明显上升;通过探究其对卵巢癌恶性细胞生物学行为的影响发现CD44-NBs联合声动力治疗组细胞克隆形成率、迁移和侵袭能力都明显下降;使用Western Blot和qRT-PC发现CD44-NBs可以降低细胞P-gp表达、增加p38 MAPK、Beclin 1的表达,从而增强声动力治疗效果。结论本课题成功制备了靶向CD44的超声纳米微泡（CD44-NBs）,其内部包裹有声敏剂姜黄素和可以提高肿瘤部位含氧量的全氟己烷。在低功率超声作用下,全氟己烷会经历从液相到气相的转变,使纳米级微泡转变为微米级微泡并成像;当微泡破裂时,包裹在其中的药物会释放出来,从而提高药物的治疗效果和靶向能力,也即在超声激发下,实现诊疗一体化。超声纳米微泡中全氟己烷既可以作为超声造影剂又可以为声动力治疗提供氧气,从而显著改善声动力治疗卵巢癌的疗效。总之,本研究为卵巢癌的诊断和治疗提供了一种潜在的新型治疗方案。
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