牛冠状病毒（Bovine coronavirus,BCoV）是导致犊牛腹泻（CD）、成年牛冬季痢疾（WD）和不同年龄段牛呼吸系统疾病（BRD）的重要病原。犊牛感染时表现出严重腹泻甚至死亡,成年牛感染时表现出产奶量显著下降。近年来,牛冠状病毒在全球流行范围较广,给世界各地养牛业的发展造成了严重的影响。目前尚无针对牛冠状病毒感染的特效治疗药物,及时发现患病动物并采取相应措施至关重要。由于临床上缺乏有效的诊断技术,因此本试验通过对牛冠状病毒N蛋白的研究,建立了检测牛冠状病毒抗体的间接ELISA方法,并对临床收集的296份奶牛血清样本进行初步检测。取得结果如下:1.成功克隆出牛冠状病毒陕西流行株S基因、N基因、HE基因、M基因和E基因。克隆的S基因与26个参考毒株的同源性为97.5%～99.3%,与中国毒株SWUN/NMG-D10/2020和CH/HB-BD/2019遗传距离最近;克隆的N基因与24个参考毒株的同源性为97.6%～99.5%,与中国毒株CH/GS-1/2019遗传距离最近;克隆的HE基因与24个参考毒株的同源性为95.8%～98.9%,与中国毒株SWUN/B9/2018和SWUN/B6/2018遗传距离最近;克隆的M基因与22个参考毒株的同源性为97.8%～99.9%,与参考毒株遗传差异不明显;克隆的E基因与18个参考毒株的同源性为99.2%～100%,与参考毒株遗传差异不明显。2.成功构建了原核表达重组质粒pET-28a-N。通过对其诱导条件的优化,最终选择1mmol/L IPTG终浓度条件下以37℃诱导6 h,经镍柱纯化后,得到了高纯度、高浓度的N蛋白,蛋白大小为50 ku。经Western blot鉴定后,重组N蛋白反应原性良好。3.成功建立基于N蛋白的牛冠状病毒抗体间接ELISA检测方法。抗原包被量为1.5μg/m L,封闭液为5%山羊血清,作用120 min,血清稀释度为1:50,作用90 min,HRP标记的山羊抗牛Ig G稀释度为1:10000,作用60 min,TMB显色10 min,阴阳性临界OD450nm值为0.256。该方法特异性、灵敏性和重复性均较好。利用本试验建立的牛冠状病毒抗体间接ELISA检测方法对临床收集的296份奶牛血清样本进行检测,其中阳性样本有54份,阳性率为18.24%。综上所述,本试验首先对牛冠状病毒陕西流行株S基因、N基因、HE基因、M基因和E基因进行了克隆及序列分析;其次构建了原核表达重组质粒,并建立了以N蛋白作为包被抗原的牛冠状病毒抗体间接ELISA检测方法,为牛冠状病毒的实验室诊断提供技术支持。