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6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m~6A)是RNA中腺嘌呤A第六位N原子被甲基化修饰形成的,也是近年来真核生物信使RNA(mRNA)中最常见、含量最多的一种转录后甲基化修饰方式。研究表明,m~6A不仅仅存在于酵母、果蝇、植物、哺乳动物等真核生物mRNA中,也存在于病毒mRNA中。此外,在真核生物其它RNA如长链非编码 RNA(LncRNA)、核糖体 RNA(rRNA)、转移 RNA(tRNA)、小核 RNA(snRNA)中也存在m~6A修饰。随着酶学研究技术的进一步发展,甲基化转移酶(METTL 3、METTL 14和WATP)和去甲基化酶(FTO、ALKBH5)的相继发现表明m~6A甲基化过程是动态可逆的,并且甲基化和去甲基化过程在基因的表达调控中起着重要作用,包括mRNA的翻译、剪接、输出和降解等。此外,m~6A与癌症、白血病等重大疾病的发生密切相关,因此检测分析RNA的中m~6A对生物学基础研究以及相关的重大疾病的诊断具有重要意义。本论文首次发现T3 DNA连接酶对m~6A具有很强的选择性,由此建立了一种基于连接-聚合酶链式反应定量分析RNA中m~6A的方法。首先选定MALAT1 LncRNA(肺癌转移相关转录本1)中包含2577th位点(该位点已经有文献报道含有m~6A修饰)的一段序列作为RNA目标序列。然后根据RNA目标序列设计两个DNA探针:左探针Probe L1和右探针ProbeR1。每条探针包含两部分,其中一部分为引物区,用来进行PCR扩增,另一部分为识别检测区,其序列和RNA目标序列互补。此外,左探针Probe L1序列的5’端修饰有磷酸基团,右探针Probe R1序列的3’端修饰有2个RNA碱基。当目标序列的2577th位点为腺嘌呤A时,左探针Probe L1和右探针Probe R1能够很好的在2577th位点与RNA目标序列杂交,然后在T3 DNA连接酶的作用下进行连接反应,连接产物又借助正反引物通过PCR进行指数扩增,扩增过程中使用荧光染料SYBR GreenI来对PCR产物进行实时荧光检测。当目标序列2577th位点的腺嘌呤A被甲基化变为m~6A时,m~6A会有效的阻碍左探针Probe L1和右Probe R1的连接,从而使连接产物和PCR扩增产物大大减少。最后根据PCR扩增产物的减少量便可以计算出该位点m~6A的含量。该方法对腺嘌呤A和m~6A的选择性区分高达54.1倍,最低能够检测4 fM含有m~6A的RNA靶分子,灵敏度与已有方法相比提高了 106倍。该方法成功应用在Hela细胞和HEK293T细胞RNA分子中m~6A的检测。