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目前,转基因牛新品种的培育更加倾向于对内源功能基因进行编辑,与以往通过整合外源基因的方式相比,在安全性和生产价值上都有了显著提升。因此,挖掘并研究与牛的疾病发生和生产性能相关的关键基因十分必要。能够在体外长期培养的永生化细胞系是分子细胞生物学研究的重要工具。然而,牛永生化细胞系的长期缺乏,使得对牛相关功能基因的研究只能借鉴人或小鼠的细胞系作为模式细胞,制约了研究的开展以及在转基因牛培育上的转化价值。因此,建立一种简便高效的牛原代细胞永生化策略具有极其重要的意义。传统的针对牛源细胞的永生化策略通常是通过瞬时转染或病毒感染的方式将人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）基因引入原代细胞基因组中,但在效率和安全性上都存在一定的缺陷。为了解决这一问题,本研究拟从引入的永生化因子和采取的基因工程手段两个方面对传统的永生化策略进行改进。我们首次证明,对于牛的原代细胞而言,牛端粒酶逆转录酶（bovineTERT,bTERT）是一个更高质量的永生化因子,并采用CRISPR/Cas9基因精确编辑技术介导其在牛基因组ROSA26位点的定点整合,建立了一套高效的永生化策略,获得了性质稳定的永生化牛胎儿成纤维细胞系（bovine fetal fibroblasts,BFFs）。此外,我们在尝试运用该策略实现牛原代骨髓源巨噬细胞（bovine bone marrow-derived macrophages,bBMMs）的永生化过程中发现,TERT的核转运及酶活性在bBMMs中受到一定程度的抑制,阻碍了TERT介导的bBMMs原代细胞的永生化。通过CRISPR/Cas9系统介导bTERT模拟磷酸化突变体插入到bBMMs基因组ROSA26位点可在一定程度上克服上述限制因素,延长bBMMs体外培养时间。本研究主要内容如下:1.首次发现bTERT是一个高质量的永生化因子。首先,我们证明bTERT在机体各组织中的表达水平受到严格调控,表达模式与hTERT相似。其次,通过RNA免疫共沉淀实验证明bTERT与人、牛、鼠和羊细胞内源性端粒酶RNA亚基均能发生相互作用,表明bTERT在多个物种的细胞中都能参与端粒酶的组装。随后,对牛、人和鼠TERT的羧基末端结构域进行截短并相互置换后,我们发现bTERT全长及其羧基末端结构域在增强端粒酶活性和维持端粒延长方面更具优势。最后,在hTERT+/-的Hela细胞中过表达bTERT,发现细胞的增殖活性以及端粒长度相比hTERT+/-的细胞克隆都得到了恢复。上述结果表明bTERT可作为新的永生化因子发挥作用,且其在牛的原代细胞中效果优于hTERT。2.运用CRISPR/Cas9基因编辑技术介导bTERT基因精确整合到b ROSA26位点,构建了一套用于牛原代细胞的高效永生化策略。在牛基因组上选择ROSA26位点作为打靶基因座,构建基因打靶载体以及相应的供体载体bTERT-HMEJ,共转染BFFs后经嘌呤霉素筛选、junction PCR和Sanger测序鉴定得到精确整合bTERT基因的阳性克隆,进一步体外培养传代后获得永生化的细胞系。我们将上述CRISPR/Cas9介导的永生化方法同瞬时转染和病毒感染介导的永生化方法进行了全面系统的对比,证明了本研究中依赖CRISPR/Cas9基因编辑手段建立的永生化策略效率更高、质量更优,表现为获得的永生化克隆的数量更多、培养代数更多、细胞活力更强且端粒长度更稳定,相对传统方法而言具有明显的优势。3.证明了基于上述永生化策略建立的BFFs永生化细胞系（bT-iBFFs）具有稳定的细胞性质,可作为模式细胞用于科学研究中。Western blot、定量PCR等实验结果证明bT-iBFFs细胞中外源整合的bTERT可正常表达且细胞类型并未发生改变,其相对端粒长度并未随着体外传代次数的增加发生明显缩短,同时传代至第80代的细胞并未发生明显衰老,仍然保留较高的增殖速率。染色体核型分析和软琼脂克隆形成试验证明bT-iBFFs细胞的染色体正常且细胞未发生恶性转变。此外,bT-iBFFs细胞具备接受二次转染与二次基因编辑的能力,并未受到抑制。4.运用上述CRISPR/Cas9基因编辑手段介导的永生化策略,尝试构建bBMMs永生化细胞系。本研究运用上述策略获得了精确整合bTERT的bBMMs阳性细胞克隆,但未能完全实现永生化。通过Western blot、免疫共沉淀等实验,我们发现bBMMs原代细胞存在阻碍TERT蛋白细胞核转运和酶活性的内源性翻译后调控因素。首先,巨噬细胞中AKT激酶的活性低,使得底物bTERT的磷酸化受到抑制,阻碍后者的细胞核转位;其次,巨噬细胞中内源性PINX1含量较高,通过与bTERT蛋白之间的相互作用,抑制其在细胞核内的功能;此外,“Shelterin”与“CST”复合体各组分在巨噬细胞中的高水平表达,均能抑制bTERT蛋白功能的发挥。运用位点突变策略结合序列比对分析发现,第231位丝氨酸残基是调控bTERT向细胞核转运的关键磷酸化位点,受到AKT激酶的调控。因此我们构建了相应的bTERT模拟磷酸化突变体bTERT-S231E,再利用CRISPR/Cas9系统将突变体基因定点整合到bBMMs细胞基因组上,可成功延长bBMMs原代细胞体外培养的时间。综上,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术介导bTERT在BFFs基因组ROSA26安全港位点上精准整合,建立了简便高效的牛原代细胞永生化策略,并成功实现了BFFs原代细胞的永生化。此外,我们发现上述策略在实现bBMMs原代细胞永生化上的局限性与bTERT在bBMMs中核转运受阻且活性受到抑制有关,首次提出原代细胞内源性因素会阻碍TERT介导的细胞永生化,并运用优化的策略延长了bBMMs细胞体外培养的时间。因此,后续在使用TERT作为永生化因子建立永生化细胞系时,需要充分考虑不同类型细胞中TERT的表达和调控模式,定制方案消除抑制TERT发挥功能的内源性因素。同时,本研究中建立的永生化策略为牛源模式细胞系的高效构建提供了有效手段,对于推动牛内源功能基因的研究及其在转基因牛培育中的应用具有重要意义。