目的人体细胞经常暴露于各种内源性和外源性损伤因素中,而活性氧（reactive oxygen species,ROS）是内外源性有害物质暴露引起细胞损伤的常见产物之一。过量的ROS积累是造成细胞损伤的重要因素,ROS积累引起的细胞损伤包括但不局限于细胞衰老和凋亡。机体细胞内产生的ROS积累会导致DNA、蛋白质和脂质的氧化损伤,这些氧化损伤的积累是引起细胞损伤的主要原因。因此,抑制ROS的积累对减少氧化应激和细胞损伤具有重要意义。目前如何降低ROS积累所致的细胞损伤已成为当今医学研究的热点,因此寻找和开发针对ROS产生和清除的物质具有重要意义。皮肤是人体的最外层器官,毛囊（hairfollicle,HF）作为哺乳动物皮肤的附属器,暴露于外源性有害因素的风险远高于机体其他组织器官,因此HF也最容易受到外源性因素的损伤,成为毒物的靶器官。本课题组前期研究结果表明,在HF生长期到退行期过渡时会有大量的ROS积累和DNA损伤产生,表明ROS介导的DNA损伤和修复在HF周期运行中具有重要作用。HF-MSCs参与HF形态发生、HF发育、HF周期运行、HF再生及HF的损伤修复等重要过程。HF-MSCs因具有容易获取和免疫原性低等优势而成为再生医学研究中重要的自体种子细胞来源。任何导致HF-MSCs内ROS过量积累的因素都可能导致HF-MSCs损伤,不仅破坏HF稳态,导致毛发缺失,也阻碍其作为种子细胞在临床上的应用。因此抑制ROS积累,减轻其对HF-MSCs造成的损伤,有望抑制脱发和促进毛发再生。前 B 细胞白血病转录因子 1（pre-B-cell leukemiahomeobox 1,PBX1）是一种维持干细胞自我更新和多潜能性的核心转录因子,在维持胚胎干细胞未分化状态和体细胞重编程以及逆转脐带间充质干细胞衰老方面均发挥重要作用。本课题前期研究结果表明过表达PBX1可抑制H2O2诱导的HF-MSCs损伤,同时伴随着聚ADP核糖聚合酶1（poly ADP ribose polymerase1,PARP1）下调。但PBX1如何抑制H2O2诱导的HF-MSCs损伤是未知的。因此本研究旨在探讨PBX1对ROS诱导的HF-MSCs损伤的保护作用及机制,为干细胞损伤的机制提供了新思路,同时也为HF形态发生、HF发育、HF再生及HF损伤修复的研究提供借鉴和参考依据。方法第一部分利用传代培养方式和外源性H2O2处理来探讨ROS对HF-MSCs的损伤作用。绘制第 3 代（third-generation passage cells,P3）和第 7 代（seventh-generation passage cells,P7）的 HF-MSCs 生长 曲线;CCK 8 法检测不 同浓度 H2O2诱导的HF-MSCs的存活率;流式细胞术检测细胞周期、ROS及细胞凋亡;衰老β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色检测HF-MSCs衰老;Annexin V-FITC-7AAD染色观察HF-MSCs凋亡;彗星实验检测DNA损伤程度;Westernblot检测细胞衰老、凋亡及DNA损伤修复相关蛋白的表达水平。第二部分通过过表达PBX1探讨PBX1对H2O2诱导的HF-MSCs损伤的保护作用。Cytation3细胞成像多功能检测系统和Westernblot检测PBX1转导效率;绘制PBX1和Vector组生长曲线;流式细胞术检测HF-MSCs内ROS水平及HF-MSCs的凋亡;衰老SA-β-gal染色检测HF-MSCs衰老;Westernblot检测细胞衰老、凋亡及DNA损伤修复相关蛋白的表达水平。第三部分通过过表达PBX1和PARP1细胞探讨PBX1对HF-MSCs保护作用的机制及PBX1能否通过降低DNA损伤或促进DNA损伤修复而降低HF-MSCs的损伤。Westernblot检测转导效率;流式细胞术检测ROS及细胞凋亡;衰老SA-β-gal 染色检测细胞衰老;Westernblot 检测细胞衰老、凋亡及 DNA 损伤修复相关蛋白的表达水平。第四部分通过过表达PBX1敲减SIRT1细胞探讨PBX1是否通过调节SIRT1-PARP1轴延缓HF-MSCs衰老和降低其凋亡。Westernblot检测转导效率;流式细胞术检测ROS及细胞凋亡;衰老SA-β-gal染色检测细胞衰老;Westernblot检测细胞衰老、凋亡及DNA损伤修复相关蛋白的表达水平。结果1.传代培养和H2O2诱导对HF-MSCs的影响1.1 传代培养对HF-MSCs的影响（1）细胞生长曲线结果表明,第8天P3细胞数明显多于P7细胞数;细胞周期结果表明P7较P3增加了 G0/G1期阻滞,减少了 S期细胞数;且P3组细胞增殖指数（proliferation index,PI）大于 P7 组的 PI。（2）DCFH-DA流式检测ROS水平发现,P3组HF-MSCs的ROS阳性率明显低于P7组。（3）彗星实验检测DNA损伤程度发现P3的DNA染色后多呈圆形的荧光团,大多数DNA无拖尾出现,个别出现拖尾现象,但拖尾程度较小,说明DNA损伤程度较轻。而P7的HF-MSCs内出现拖尾的DNA数量较多,且彗星尾较长,说明DNA受损较严重,断裂较多,产生的碎片也多,DNA碎片在电场的作用下迁移的距离也较长。P7的HF-MSCs内DNA损伤相关蛋白γH2AX的表达水平明显高于P3;P7的HF-MSCs内DNA损伤修复蛋白PARP1 116kDa、PAR、Ku80、Ku70及Rad51的表达水平较P3显著下调。（4）衰老SA-β-gal染色表明P7的HF-MSCs衰老阳性率明显高于P3;P7的HF-MSCs内衰老相关蛋白P53、P21及P16的表达高于P3。（5）利用Annexin V/PI染色观察各组均可见凋亡的HF-MSCs,其中早期凋亡的HF-MSCs细胞膜呈绿色荧光,晚期凋亡的HF-MSCs核呈红色荧光,且P7的早期和晚期凋亡细胞数量多于P3;Annexin V/7AAD流式结果与染色结果一致表明P7的HF-MSCs凋亡率明显高于P3;P7的HF-MSCs内凋亡相关蛋白AIF 57 kDa、Cyt C 及 Cleaved-Caspase 3 的表达高于 P3。1.2 H2O2诱导对HF-MSCs的影响（1）通过 CCK-8 法检测不同浓度（0μM、50 μM、75 μM、100 μM、125μM）H2O2处理2h的细胞存活率,在一定的H2O2浓度范围内,随着H2O2浓度增加,HF-MSCs存活率逐渐下降。（2）DCFH-DA荧光探针流式检测ROS水平发现,在一定浓度范围内,随着H2O2浓度增加,HF-MSCs内ROS积累。100 μM和125 μM H2O2处理组HF-MSCs细胞ROS阳性率均明显高于对照组。（3）在一定浓度范围内,随着H2O2浓度增加,HF-MSCs内DNA损伤相关蛋白γH2AX的表达水平明显升高;100 μtM和125 μM H2O2处理组与对照组相比,γH2AX的表达明显增加。（4）衰老SA-β-gal染色结果表明,在一定浓度范围内,随着H2O2浓度增加,HF-MSCs的衰老阳性率明显增加。100 μM和125μM H2O2处理组的衰老阳性率明显高于对照组。100 μM和125 μM H2O2处理组的HF-MSCs内衰老相关蛋白P53、P21及P16的表达水平显著高于对照组。（5）利用Annexin V/PI染色观察各组均可见凋亡的HF-MSCs,且100 μM和125 μM H2O2处理组HF-MSCs的早期和晚期凋亡数量多于对照组;Annexin V/PI流式结果与染色结果一致表明100 μM和125 μM H2O2处理组HF-MSCs凋亡率明显高于对照组。125 μM H2O2处理组的HF-MSCs内凋亡相关蛋白AIF 57 kDa、Cyt C及Cleaved-Caspase 3的表达水平也显著高于对照组。2.PBX1对H2O2诱导的HF-MSCs的保护作用2.1 PBX1对HF-MSCs的保护作用（1）Cytation 3细胞成像多功能检测系统观察和Westernblot检测结果均表明已成功构建过表达PBX1的HF-MSCs模型。双萤光素酶报告基因检测发现PBX1组SIRT1启动子萤光素酶活性高于Vector组,过表达PBX1可上调SIRT1启动子萤光素酶活性,促进SIRT1转录。（2）细胞生长曲线结果表明,第8天PBX1组细胞数明显多于Vector和Control 组。（3）DCFH-DA流式检测ROS水平发现,PBX1组HF-MSCs的ROS阳性率明显低于Vector和Control组。（4）Vector和Control组HF-MSCs内DNA损伤相关蛋白γH2AX的表达水平明显高于PBX1组,PBX1组DNA损伤修复蛋白PARP1 116kDa、PAR、Ku80、Ku70及Rad51的表达水平较Vector组显著下调。（5）衰老SA-β-gal染色表明PBX1组HF-MSCs的衰老阳性率明显低于Vector组,PBX1组HF-MSCs内衰老相关蛋白P53、P21及P16的表达低于Vector和 Control 组。（6）Annexin V/PI流式结果表明PBX1组HF-MSCs的凋亡率低于Vector组,PBX1 组 HF-MSCs 内凋亡相关蛋白 AIF 57 kDa、Cyt C 及 Cleaved-Caspase 3的表达低于Vector组。2.2 PBX1对外源性H2O2诱导的HF-MSCs的保护作用（1）Westernblot检测结果表明PBX1组HF-MSCs内PBX1的表达水平明显高于Vector和Control组,PBX1+H2O2组HF-MSCs内PBX1的表达水平明显高于 Vector+H2O2 组。（2）DCFH-DA 流式检测 HF-MSCs 内 ROS 水平发现,PBX1 组 HF-MSCs的ROS阳性率明显低于Vector组;H2O2组ROS阳性率明显高于Control组;PBX1+H2O2组ROS阳性率明显低于Vector+H2O2组。（3）PBX1组HF-MSCs内DNA损伤相关蛋白γH2AX的表达水平明显低于 Vector 组;PBX1 组 HF-MSCs 内 DNA 损伤修复蛋白 PARP1 116kDa、PAR、Ku80、Ku70及Rad51的表达水平较Vector组显著下调。H2O2组HF-MSCs内DNA损伤相关蛋白γH2AX的表达水平高于Control组;H2O2组HF-MSCs内DNA损伤修复蛋白PARP1 116 kDa、PAR、Ku80、Ku70及Rad51的表达水平较Control组显著上调。PBX1+H2O2组HF-MSCs内DNA损伤相关蛋白γH2AX的表达水平明显低于Vector+H2O2组;PBX1+H2O2组HF-MSCs内DNA损伤修复蛋白PARP1 116 kDa、PAR、Ku80、Ku70 及 Rad51 的表达水平较 Vector+H2O2 组显著下调。（4）衰老SA-β-gal染色表明PBX1组HF-MSCs的衰老阳性率明显低于Vector组;PBX1组HF-MSCs内衰老相关蛋白P53、P21及P16的表达低于Vector组。H2O2组HF-MSCs的衰老阳性率明显高于Control组;H2O2组HF-MSCs内衰老相关蛋白P53、P21及P16的表达高于Control组。PBX1+H2O2组HF-MSCs的衰老阳性率明显低于Vector+H2O2组;PBX1+H2O2组HF-MSCs内衰老相关蛋白P53、P21 及 P16 的表达低于 Vector+H2O2 组。（5）Annexin V/PI流式结果表明PBX1组HF-MSCs的凋亡率低于Vector组;PBX1 组 HF-MSCs 内凋亡相关蛋白 AIF 57 kDa、Cyt C 及 Cleaved-Caspase 3 的表达低于Vector组。H2O2组HF-MSCs的凋亡率高于Control组;H2O2组HF-MSCs 内凋亡相关蛋白 AIF 57 kDa、Cyt C 及 Cleaved-Caspase 3 的表达高于 Control组;PBX1+H2O2 组 HF-MSCs 的凋亡率低于 Vector+H2O2 组;PBX1+H2O2 组 HF-MSCs内凋亡相关蛋白AIF 57 kDa、Cyt C及Cleaved-Caspase 3的表达低于Vec-tor+H2O23.过表达PBX1可降低过表达PARP1导致的细胞损伤（1）Westernblot检测结果表明PBX1组HF-MSCs内PBX1的表达水平明显高于Vector组;PBX1+PARP1组HF-MSCs内PBX1的表达水平明显高于Vector+PARP1组。PBX1 组 HF-MSCs 内 PARP1 的表达水平低于 Vector;PARP1组HF-MSCs内PARP1的表达水平明显高于Vector组;PBX1+PARP1组HF-MSCs内PARP1的表达水平明显低于Vector+PARP1组。（2）DCFH-DA流式检测ROS水平发现,PBX1组HF-MSCs的ROS阳性率明显低于Vector组;PARP1组ROS阳性细胞率明显多于Vector组;PBX1+PARP1组ROS阳性细胞率明显低于Vector+PARP1组。（3）PBX1组HF-MSCs内DNA损伤相关蛋白γH2AX的表达水平明显低于 Vector 组;PBX1 组 HF-MSCs 内 DNA 损伤修复蛋白 PARP1 116kDa、PAR、Ku80及Ku70的表达水平较Vector组显著下调。PARP1组HF-MSCs内DNA损伤相关蛋白γH2AX的表达水平高于Vector组;PARP1组HF-MSCs内DNA损伤修复蛋白PARP1 116 kDa、PAR、Ku80、Ku70及Rad51的表达水平较Vector组显著上调。PBX1+PARP1组HF-MSCs内DNA损伤相关蛋白γH2AX的表达水平明显低于Vector+PARP1组;PBX1+PARP1组HF-MSCs内DNA损伤修复蛋白PARP1 116 kDa、PAR、Ku80、Ku70 及 Rad51 的表达水平较 Vector+PARP1 组显著下调。（4）衰老SA-β-gal染色表明PBX1组HF-MSCs的衰老阳性率明显低于Vector组;PBX1组HF-MSCs内衰老相关蛋白P53、P21及P16的表达低于Vector组。PARP1组HF-MSCs的衰老阳性率明显高于Vector组;PARP1组HF-MSCs内衰老相关蛋白P53、P21及P16的表达高于Vector组。PBX1+PARP1组HF-MSCs的衰老阳性率明显低于Vector+PARP1组;PBX1+PARP1组HF-MSCs内衰老相关蛋白P53、P21及P16的表达低于Vector+PARP1组。（5）Annexin V/PI流式结果表明PBX1组HF-MSCs的凋亡率低于Vector组;PBX1 组 HF-MSCs 内凋亡相关蛋白 AIF 57 kDa、Cyt C 及 Cleaved-Caspase 3 的表达低于Vector组。PARP1组HF-MSCs的凋亡率高于Vector组;PARP1组HF-MSCs内凋亡相关蛋白AIF 57kDa、Cyt C及Cleaved-Caspase 3的表达高于Vector组;PBX1+PARP1 组 HF-MSCs 的凋亡率低于 Vector+PARP1 组;PBX1+PARP1 组HF-MSCs内凋亡相关蛋白AIF 57 kDa、Cyt C及Cleaved-Caspase 3的表达低于Vector+PARP1。4.PBX1可通过调节SIRT1-PARP1轴降低HF-MSCs损伤4.1敲减SIRT1可增加HF-MSCs的损伤（1）Westernblot结果表明SiSIRT1组HF-MSCs内SIRT1的表达水平明显低于SiNC组。SiSIRT1组HF-MSCs内PARP1的表达水平高于SiNC组。SiSIRT1组HF-MSCs内ATP及NAD水平均明显低于SiNC组。SiSIRT1组HF-MSCs内PBX1蛋白的表达水平也低于SiNC组。（2）利用DCFH-DA检测敲减SIRT1的HF-MSCs内ROS的水平,结果表明SiSIRT1组HF-MSCs的ROS阳性率明显高于SiNC组。SiSIRT1组HF-MSCs内FOXO1和PGC1α的表达水平明显低于SiNC组。（3）SiSIRT1组HF-MSCs内DNA损伤相关蛋白γH2AX的表达水平明显高于SiNC组。SiSIRT1组HF-MSCs内的DNA损伤修复蛋白Ku80、Ku70及Rad51的表达水平较SiNC组显著下调。（4）衰老SA-β-gal染色表明SiSIRT1组HF-MSCs衰老阳性率高于SiNC组。SiSIRT1组HF-MSCs内衰老相关蛋白P53、P21及P16的表达高于SiNC组。（5）Annexin V/7AAD流式结果表明SiSIRT1组HF-MSCs凋亡率高于SiNC组。SiSIRT1 组 HF-MSCs 内凋亡相关蛋白 AIF 57 kDa、Cyt C 及 Cleaved-Caspase 3的表达均高于SiNC组。4.2 PBX1可通过调节SIRT1-PARP1轴降低HF-MSCs损伤（1）Westernblot结果表明PBX1组HF-MSCs内PARP1的表达明显低于Vector 组,PBX1 组 HF-MSCs 内 SIRT1 的表达明显高于 Vector 组。SiSIRT1 组HF-MSCs 内 PARP1 的表达高于 Control 组,SiSIRT1 组 HF-MSCs 内 SIRT1 的表达低于 Control 组。PBX1+SiNC 组 HF-MSCs 内 PARP1 的表达低于 Vector+SiNC组,PBX1+SiSIRT1 组 HF-MSCs 内 SIRT1 的表达高于 Vector+SiSIRT1 组。（2）衰老SA-β-gal染色表明PBX1组HF-MSCs衰老阳性率明显低于Vector组。PBX1组HF-MSCs内衰老相关蛋白P53、P21及P16的表达低于Vector组。SiSIRT1组HF-MSCs衰老阳性率明显高于Control组。SiSIRT1组HF-MSCs内衰老相关蛋白P53、P21及P16的表达高于Control组。PBX1+SiSIRT1组HF-MSCs 衰老阳性率明显低于 Vector+SiSIRT1 组。PBX1+SiSIRT1 组 HF-MSCs 内衰老相关蛋白P53、P21及P16的表达低于Vector+SiSIRT1组。（3）Annexin V/7AAD流式结果表明PBX1组HF-MSCs凋亡率低于Vector组。PBX1 组 HF-MSCs 内凋亡相关蛋白 AIF 57 kDa、Cyt C 及 Cleaved-Caspase3的表达低于Vector组。SiSIRT1组HF-MSCs的凋亡率高于Control组。SiSIRT1组HF-MSCs内细胞凋亡相关蛋白AIF 57 kDa、Cyt C及Cleaved-Caspase 3的表达高于 Control 组。PBX1+SiSIRT1 组 HF-MSCs 凋亡率低于 Vector+SiSIRT1 组。PBX1+SiSIRT1 组 HF-MSCs 细胞凋亡相关蛋白 AIF 57 kDa、Cyt C 及 Cleaved-Caspase 3 的表达低于 Vector+SiSIRT1。（4）DCFH-DA流式检测ROS水平发现,PBX1组HF-MSCs的ROS阳性率明显低于Vector组。SiSIRT1组HF-MSCs的ROS阳性细胞率明显多于Control组。PBX1+SiSIRT1 组 HF-MSCs 的 ROS 阳性细胞率低于 Vector+SiSIRT1 组。Westernblot结果表明PBX1组HF-MSCs内FOXO1和PGC1α的表达水平明显高于Vector组。SiSIRT1组HF-MSCs内FOXO1和PGC1α的表达水平明显低于 Control 组。PBX1+SiSIRT1 组 HF-MSCs 内 FOXO1 和 PGC1α 的表达水平明显高于 Vector+SiSIRT1 组。（5）PBX1组HF-MSCs内DNA损伤相关蛋白γH2AX的表达水平明显低于Vector组。PBX1组HF-MSCs内DNA损伤修复蛋白Rad51、Ku80及Ku70的表达水平较Vector组显著下调。SiSIRT1组HF-MSCs内γH2AX的表达水平明显高于Control组。PBX1+SiSIRT1组HF-MSCs内γH2AX的表达水平低于Vector+SiSIRT1 组。结论1.ROS可诱导HF-MSCs衰老和凋亡,伴随着DNA损伤积累、PBX1下调和PARP1上调。2.过表达PBX1可抑制细胞内ROS积累,同时降低ROS介导的衰老和凋亡,伴随着SIRT1表达上调和PARP1下调。3.过表达PBX1可拯救过表达PARP1所致的ROS蓄积和降低过表达PARP1诱导的HF-MSCs衰老和凋亡,伴随的是SIRT1表达上调。4.过表达PBX1可上调SIRT1和下调PARP1的表达,PBX1和SIRT1间存在相互作用环路,过表达PBX1可通过上调SIRT1-PARP1轴降低HF-MSCs衰老和凋亡。