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RIP家族在介导细胞炎症应答、氧化应激及死亡中扮演关键角色,其中RIPK1作为NF-κB通路上游重要调控因子,涉及炎症和死亡的多条细胞通路。表皮细胞构成了人体最外层屏障,是环境刺激尤其是辐射的主要作用点。我们在前期工作中发现,辐射诱导表皮细胞死亡、炎症反应及氧化应激而造成损伤,因此我们以常用的表皮细胞模型Ha CaT为靶细胞,探究RIPK1在辐射诱导的表皮细胞炎症反应和死亡中的调节作用。构建RIPK1基因稳定敲除的细胞模型是研究其功能的基础,而CRISPR/Cas系统作为新型基因编辑技术,可对基因信息进行快速精准修饰,具有明显的优势。本研究中,我们利用CRISPR/Cas9技术构建了RIPK1稳定敲除的Ha Ca T细胞株,在此基础上对RIPK1缺失时HaCaT细胞生物学特性进行初步探究。主要分为以下两部分:第一部分:完全敲除RIPK1基因的Ha CaT细胞模型的构建。首先针对GenBank中人RIPK1基因序列,设计靶向RIPK1不同外显子的4条sg RNA,并分别将其克隆至SpCas9-2A-Puro V2.0(PX459)载体中,获得4个PX459-sgRNA基因敲除载体。利用表达绿色荧光蛋白的pSpCas9n(BB)-2A-GFP(PX461)优化细胞转染条件,并通过野生型Ha CaT细胞确定嘌呤霉素筛选浓度。在上述实验结果的基础上,将重组载体PX459-sgRNA分别转染Ha CaT细胞,嘌呤霉素筛选并提取混合克隆蛋白并通过免疫印迹鉴定,确定RIPK1敲除效率最高的重组载体。将上述敲除效率最高的混合克隆,通过有限稀释法获得单克隆细胞株,免疫印迹和DNA测序技术进一步鉴定RIPK1敲除效果最佳的单克隆。结果表明,成功构建了靶向人类RIPK1基因的高效敲除载体PX459-sgRNA2,并获得RIPK1完全敲除的HaCa T细胞模型。第二部分:RIPK1缺失对HaCaT细胞生物学特性的影响。CCK-8实验检测RIPK1缺失对细胞增殖能力的影响。流式细胞术检测RIPK1的缺失对细胞周期及细胞凋亡的影响。分别用TNF-α处理HaCaTWT细胞和HaCaTRIP1KO细胞,流式细胞仪检测敲除RIPK1对TNF-α诱导细胞死亡的影响,进一步通过caspase抑制剂Z-VAD-FMK判断细胞死亡类型,Western印迹检测NF-κB通路和凋亡相关蛋白的活化。此外,分别用UVB照射HaCaTWT细胞和HaCa TRIP1KO细胞,CCK-8实验检测UVB照射对两种细胞活力的影响,ELISA检测炎性因子IL-1α的表达,Western印迹检测NF-κB通路、P38 MAPK通路及凋亡相关蛋白的活化。结果显示敲除RIPK1对静息期Ha CaT细胞形态及细胞凋亡未产生明显影响,但导致细胞增殖能力减慢及细胞周期G2M期的阻滞;与野生型细胞相比,HaCaTRIP1KO对TNF-α诱导的细胞凋亡异常敏感,可能与NF-κB通路的抑制相关;此外,敲除RIPK1导致UVB对细胞的生长抑制更加显著,且上调炎性因子IL-1α的表达,P38 MAPK和NF-κB通路可能参与该过程。本研究成功构建了RIPK1稳定敲除的HaCa T细胞模型,并对RIPK1的生物学功能进行了探究,不仅为进一步探明表皮细胞中RIPK1对促存活信号的调控作用,也为探究辐射损伤机制及相关药物靶点开发奠定了工作基础。