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卵母细胞在减数分裂过程中需要不断积累所需营养物质为成熟及胚胎发育作准备。雌激素作为一种重要的生殖激素,在卵母细胞成熟发育过程中起到不可替代的作用。已有证据表明,自噬(Autophagy)作为一种细胞生存机制,在体细胞及颗粒细胞的氧化应激、细胞凋亡及衰老等方面具有重要作用,而有关自噬与卵母细胞发育的研究较少,在此过程中雌激素与自噬之间的联系更是不明确。基于此,本研究利用小分子抑制剂、免疫组织化学、细胞免疫荧光和Western blot等技术与方法,解析自噬在雌激素调控下对卵母细胞成熟和胚胎发育的作用;揭示雌激素对卵母细胞自噬的影响;明确雌激素介导的自噬对成熟卵母细胞氧化应激和早期凋亡的机制;掌握雌激素参与自噬调控的细胞间隙连接通讯的作用途径;探究雌激素受体对自噬的分子途径。以期系统阐明雌激素与自噬对卵母细胞成熟发育的联合调控作用机制,为提高猪卵母细胞质量、增加成熟卵母细胞的胚胎发育能力提供科学依据。本研究获得的主要结果和结论如下:1.在卵母细胞体外成熟过程中添加0.1μM和1μM的17β-雌二醇,成熟率均显著提高(P<0.05),并且在1μM的17β-雌二醇处理下,成熟率以时间依赖性的方式逐渐上升;自噬主要在猪卵母细胞、卵丘细胞和颗粒细胞中发生;在用自噬抑制剂Autophinib对自噬抑制的过程中,卵母细胞成熟率以剂量依赖的方式下降,通过添加17β-雌二醇可以缓解成熟率下降的趋势;用Autophinib抑制自噬的过程中,卵母细胞的卵裂率也以Autophinib的剂量依赖的方式下降,通过添加17β-雌二醇可以缓解卵裂率以及囊胚率下降的趋势(P<0.05)。这些结果表明,雌激素可以介导自噬参与的卵母细胞成熟以及胚胎发育。2.17β-雌二醇处理后的MII期卵母细胞中,自噬降解蛋白SQSTM1的表达低于空白对照(P<0.05);在卵母细胞体外成熟早期,17β-雌二醇可以提高自噬标志蛋白LC3-II的表达(P<0.05),并使SQSTM1的表达处于较低的水平,这些结果表明雌激素促进卵母细胞自噬的发生;用自噬抑制剂Autophinib处理成熟卵母细胞后,LC3-II蛋白的表达以剂量依赖的方式下降,证明Autophinib可以有效抑制猪卵母细胞的自噬;在猪卵母细胞中,17β-雌二醇可以显著提高Autophinib抑制的自噬(P<0.05)。这些发现证明了雌激素参与卵母细胞成熟过程中的自噬反应。3.自噬的抑制导致成熟卵母细胞出现更高ROS水平(P<0.01)和异常线粒体分布(P<0.05),17β-雌二醇的处理与自噬抑制剂Autophinib处理相比,不仅ROS的水平较低(P<0.01),而且线粒体的分布更加均匀(P<0.01),在17β-雌二醇加入自噬抑制剂Autophinib组处理后,可以显著降低ROS的水平(P<0.05),并且可以修复线粒体的异常分布(P<0.05)。17β-雌二醇处理的成熟卵母细胞内游离Ca2+的含量较低,而自噬抑制剂Autophinib处理后没有显著变化,当共同处理后的Ca2+的含量显著上升(P<0.05)。这些证据说明成熟卵母细胞中雌激素可以降低由自噬抑制导致的氧化应激作用,这一作用可能依赖于上调线粒体的正常分布和Ca2+的含量。通过早期细胞凋亡分析发现,抑制自噬增加了成熟卵母细胞的凋亡率(P<0.01),这个作用可以被17β-雌二醇显著下调(P<0.05);伴随着自噬的抑制,成熟卵母细胞中线粒体的功能发生障碍(P<0.01),而17β-雌二醇具有线粒体功能修复的作用,可以显著改善由自噬抑制导致的线粒体功能障碍;进一步研究揭示,自噬抑制导致的凋亡率上升可能是通过激活caspase-8进而增加caspase-3的裂解所导致(P<0.05),而17β-雌二醇虽然也可以激活caspase-8(P<0.05),但对caspase-3的裂解能力显著抑制(P<0.05),从而进一步降低由自噬抑制介导的caspase-3活性(P<0.05)。这些结果证明17β-雌二醇通过介导凋亡相关蛋白和修复线粒体功能紊乱,从而降低自噬抑制引起的卵母细胞的凋亡。4.在猪卵母细胞成熟过程中,卵丘-卵母细胞的间隙连接细胞通讯(gap junctional intercellular communication,GJICs)以时间依赖的方式降低。17β-雌二醇在体外成熟早期可以显著降低间隙连接通讯(P<0.05),而自噬的抑制可以显著提高间隙连接(P<0.01),此外,17β-雌二醇可以下调自噬抑制介导的间隙连接(P<0.05);通过分析卵丘-卵母细胞亚细胞结构,发现结果与间隙连接一致,即抑制自噬可以显著提高跨带突触(Transzonal projections,TZPs)的数量(P<0.01),这一过程被17β-雌二醇下调(P<0.05)。进一步研究发现,17β-雌二醇不仅下调连接蛋白Cx43的磷酸化水平(P<0.05),同时也可以降低自噬抑制导致的Cx43磷酸化修饰(P<0.05)。这些结果说明雌激素下调自噬抑制的猪卵丘-卵母细胞间隙连接通讯可能依赖于下调Cx43的磷酸化修饰。5.GPR30是雌激素位于质膜上的新型受体,在猪卵母细胞体外成熟期间以时间依赖的方式下降,而17β-雌二醇可以保持GPR30在体外成熟过程中的高表达。使用G15(GPR30特异性抑制剂)处理后,完全消除了17β-雌二醇对核成熟的促进作用(P<0.05)。GPR30的失活可以下调17β-雌二醇对MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平(P<0.05),这表明GPR30通过MEK/ERK通路对猪卵母细胞进行调控。进一步分析显示,MEK1/2和ERK1/2的失活可以促进SQSTM1的表达(P<0.05),并且通过降低LC3-II的水平来抑制自噬(P<0.05)。这些结果揭示了由17β-雌二醇诱导的GPR30通过MEK/ERK信号通路促进自噬的发生,从而促进猪卵母细胞成熟。综上所述,17β-雌二醇与猪卵母细胞自噬的发生密切相关,17β-雌二醇可以促进猪卵母细胞的自噬,添加适当浓度可以提高卵母细胞成熟和早期胚胎的发育能力,降低由自噬抑制剂Autophinib导致的ROS水平升高和早期凋亡的发生,并且下调猪卵母细胞成熟早期的间隙连接细胞通讯。17β-雌二醇对猪卵母细胞自噬的促进作用可能是通过GPR30/MEK/ERK途径进行,从而促进了卵母细胞的成熟。这些发现可以为猪卵泡闭锁调控机理研究提供新的理论依据。