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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的急性、高度传染性消化道疾病。PED具有传播快、流行广和致死率高等特点,自2011年起该病对全球的养猪业造成了毁灭性的打击。尽管PEDV公认的传播方式是粪-口传播,但最近越来越多的研究表明该病毒也能通过空气传播并能够进入仔猪鼻腔,因此本研究提出PEDV能够经鼻腔引起仔猪肠道发病的假说。为验证这一假说,首先通过喷鼻PEDV攻毒5日龄仔猪,观察仔猪的临床症状,结果表明喷鼻感染60 h后仔猪出现典型的PED样腹泻症状,并有大量病毒定殖于小肠上皮中。于是本研究将围绕这一现象,具体探讨PEDV经鼻腔黏膜入侵后经体内扩散,最终引起仔猪肠道发病的相关机制。试验结果表明PEDV能够通过鼻腔黏膜下的树突状细胞(Dendritic cells,DCs)的主动摄取进入鼻腔黏膜固有层,随后摄取病毒的DCs能够进入附近的引流淋巴结并将病毒传递给T淋巴细胞,进一步携带病毒的T淋巴细胞能够进入肠道黏膜固有层并通过直接接触传递病毒给肠道上皮细胞。本研究具体内容分为以下四个部分:1.动物试验验证PEDV能经鼻腔入侵引起哺乳仔猪肠道发病研究表明使用500 μL 1 ×107PFU/mL PEDV喷鼻感染5日龄仔猪60 h后,能使仔猪出现典型的腹泻症状和肠道病理变化,免疫荧光染色显示有大量PEDV在仔猪的小肠中定殖。通过免疫组化和流式细胞术检测后发现,PEDV主要分布于鼻腔黏膜的嗅区,其能够低水平的感染鼻腔黏膜上皮细胞。为进一步验证体内试验结果,体外建立鼻腔上皮细胞气液培养模型(Nasal epithelial cell air-liquid culture model,NECAM)后检测其对PEDV的易感性。空斑试验结果表明PEDV虽然能在鼻腔上皮细胞中复制,但并不能引起鼻腔上皮细胞的细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE),此外PEDV只能从NECAM上室的培养基中被检出。因此本研究表明PEDV能够经鼻腔黏膜感染哺乳仔猪,病毒在鼻腔上皮细胞中表现为低水平复制并只能通过游离端释放。2.DCs跨越鼻腔上皮细胞摄取PEDV的研究黏膜下分布有较多的DCs,正常生理状态下发挥免疫监视功能。同时DCs也可被病毒所劫持,成为病毒入侵宿主黏膜屏障的一种重要方式。本试验发现喷鼻感染12 h后,携带PEDV的DCs的能够存在于仔猪鼻相关淋巴组织和鼻腔黏膜固有层中。为了进一步研究病毒进入DCs的具体方式,通过体外建立DCs/NECAM共培养模型,发现PEDV能在不破坏鼻腔上皮屏障完整性的前提下,进入到鼻腔上皮屏障下的DCs中,在此过程中DCs能够伸长树突跨越鼻腔上皮屏障主动摄取PEDV。为了进一步探索DCs摄取病毒的具体机制,我们对PEDV接种后鼻腔上皮细胞趋化因子的分泌以及相关信号通路的激活情况进行了研究。结果显示PEDV能够通过激活鼻腔上皮细胞NF-κB信号通路促进趋化因子(Chemokines 25,CCL25)的分泌。进一步使用NF-κB的抑制剂提前处理DCs/NECAM共培养模型,接种PEDV后发现DCs的跨细胞树突的形成和病毒摄取量明显降低。上述结果表明PEDV感染鼻腔上皮细胞后能通过促进鼻腔上皮细胞CCL25的释放,募集并诱导上皮下DCs伸出树突主动摄取PEDV。3.摄取病毒的DCs将病毒传递给T淋巴细胞的研究携带病毒的DCs能够进入附近的引流淋巴结并与其中的T淋巴细胞发生相互作用。喷鼻感染试验后,荧光定量和流式检测结果表明PEDV能够进入到仔猪的外周血T淋巴细胞中,T淋巴细胞中的病毒可能来自于DCs。通过体外传递试验,流式结果显示DCs能够将完整的PEDV病毒颗粒传递给T淋巴细胞。进一步通过透射电镜观察发现,在PEDV从DCs传递到T淋巴细胞的过程中病毒能够诱导DCs和T淋巴细胞之间类病毒突触的形成,该结构可能在病毒传递中扮演重要作用。4.携带PEDV的T淋巴细胞进入肠道黏膜并传递病毒给上皮细胞的研究淋巴结中的T淋巴细胞能经淋巴再循环进入外周血,最终经血液循环到达全身组织。在本实验中,淋巴细胞体内回输竞争试验表明携带病毒的T淋巴细胞能够更多的进入肠道黏膜固有层;进一步通过T淋巴细胞/上皮细胞的体外共培养模型,发现携带病毒的T淋巴细胞主要通过直接接触将病毒传递给上皮细胞,并且共培养2 h T淋巴细胞就能够将PEDV传递给上皮细胞,而感染PEDV的上皮细胞能够将病毒高效的传递给T淋巴细胞。PEDV在T淋巴细胞和上皮细胞之间的这种相互传递方式能够有效的避免肠道防御成分对病毒的杀伤,从而有利于病毒在肠道黏膜中的持续感染和扩散。本研究证明了 PEDV能够经鼻腔黏膜入侵引起仔猪的肠道感染,并对其从入侵部位到致病部位的体内扩散机制进行了研究。本文的研究结果将为我国有效预防和控制PED的发生提供重要的理论依据。