论文部分内容阅读
[目的]下咽癌占下咽原发恶性肿瘤的95%,属于头颈部鳞状细胞癌(HNSCC),多发生于梨状窝区,位置隐匿。是上消化呼吸道恶性程度最高的肿瘤之一,近年来发病率呈逐年上升趋势。由于其症状不明显,易被混淆和忽视,所以患者被确诊时大都已中晚期。如何彻底清除癌肿,同时保留功能,减少复发,提高生存率,一直是临床医生探索的方向。纳米金(Nano gold)指金的微小颗粒,制备一定尺寸且可控纵横比的纳米金棒就能够允许以一个相当直接的方式剪裁它们的光学性质。当制备纳米金棒的纵横比为3.9时,800nm波长的近红外光照射可以引起棒表层导带电子发生相干最大震荡,此即为表面等离子共振现象(surface plasmon resonance,SPR),吸收的光能转换成大量的热,这些瞬间产生的热量足够有效地摧毁肿瘤细胞而不会损伤周围的正常细胞组织,从而达到细胞水平杀灭肿瘤细胞的目的,这就是等离子体共振光热治疗(Plasmonic photothermal therapy,PPTT)的理论基础。80%-90%的头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的患者已被证实为EGFR过度表达。目前,EGFR单抗(EGFR-mAb)作为Au-NRs常用的功能化修饰物被大量研究。众多的实验研究表明,这种稳定结合后的EGFR-mAb/GNRs共轭物可以选择性地结合在高表达EGFR的头颈鳞癌细胞膜上而使其具有靶向性。本实验应用近红外激光对富集于下咽癌肿瘤细胞的EGFR单克隆抗体修饰的纳米金棒进行激发,验证光热效应靶向诱导下咽癌肿瘤细胞凋亡,并在PI3K/Akt途径下探讨近红外激光激发下纳米金棒诱导肿瘤细胞凋亡的机制。我们从以下几个方面进行研究:① 观察mAb-EGFR功能化修饰的纳米金棒在下咽癌FaDu肿瘤细胞中的聚集及纳米金棒与肿瘤细胞的相互作用;②检测纳米金棒对于下咽癌肿瘤细胞的细胞毒性,并以未表达EGFR的非肿瘤细胞293T作为对照;③检测mAb-EGFR功能化修饰的纳米金棒诱导下咽癌FaDu肿瘤细胞凋亡;④探讨PI3K/Akt/mTOR信号通路在mAb-EGFR/AuNRs光热诱导下咽癌FaDu细胞凋亡中的作用机制。[方法]实验采用纵横比约为3.9的纳米金棒,将其表面修饰表皮生长因子受体单克隆抗体(Epidermal growth factor receptor monoclonal antibody,mAb-EGFR),在波长808nm的近红外激光的照射下,利用纳米金棒的等离子共振效应诱导人下癌FaDu细胞凋亡。第一部分:mAb-EGFR功能化修饰的纳米金棒与肿瘤细胞和非肿瘤细胞的相互作用,探索体外实验中纳米金棒浓度,共聚焦显微镜观察纳米金棒在细胞中的聚集,纳米金棒与FaDu细胞作用的细胞毒性分析(LDH法)及光热效应的温度变化分析。第二部分:mAb-EGFR功能化修饰的纳米金棒光热效应诱导人咽癌FaDu细胞凋亡。验证mAb-EGFR功能化修饰的纳米金棒在波长808nm的近红外激光的照射下,等离子共振效应诱导人下咽癌FaDu细胞凋亡;采用AnexinV-PI染色法,流式细胞仪,ELISA法,荧光显微镜观察FaDu肿瘤细胞的凋亡情况。第三部分:在PI3K/Akt信号途径和DNA损伤通路下探讨纳米金棒在近红外激光光热诱导FaDu细胞凋亡的机制,实验采用Western Blot免疫印迹法和Q-PCR法分析PI3K/Akt信号通路途径上Akt,PTEN,P53等因子的变化趋势和可能的细胞凋亡机制,在体外实验中探索新型的靶向治疗因子。各实验数据采用对比研究方法进行统计处理。[结果]1、mAb-EGFR功能化修饰的纳米金棒进入FaDu细胞的数量明显多于未经修饰的纳米金棒进入FaDu细胞的数量,并且纳米金棒聚集于胞浆,甚至可以进入细胞核。对于293T细胞,mAb-EGFR功能化修饰的纳米金棒进入细胞的数量明显低于未经修饰的纳米金棒。说明mAb-EGFR功能化修饰的纳米金棒对于FaDu细胞具有一定靶向性。2、加入相同体积(浓度为15%-25%)的mAb-EGFR/Au+NIR组比较,纳米金棒对于FaDu肿瘤细胞的细胞毒性高于293T细胞(P<0.01)。对于293T细胞相同体积(浓度为15%-25%)的Au+NIR组比较,mAb-EGFR/Au+NIR组的细胞毒性明显降低(P<0.01)。3、用均数说明未经mAb-EGFR功能化修饰的纳米金棒对于下咽癌FaDu细胞和非肿瘤细胞293T细胞在近红外激光的照射下也表现为照射时间越长,温度越高(P<0.01)。并且相同剂量条件下mAb-EGFR功能化修饰的纳米金棒对于下咽癌FaDu细胞和非肿瘤细胞293T细胞在近红外激光的照射下与未经mAb-EGFR功能化修饰的纳米金棒相比较产热温度更高(P<0.01)。4、AnnexinV/PI 流式细胞仪,Tunel 法及 Western Blot 检测 Bal-2、Bax、Caspase3和Caspase9均显示mAb-EGFR功能化修饰的纳米金棒在近红外激光下诱导下咽癌FaDu细胞发生凋亡。5、Q-PCR和Western Blot法检测PI3K信号通路和DNA损伤通路中各因子,mAb-EGFR/Au+NIR组的总AKT与其余各组没有出现明显的改变,但是对于P-AKT-S473 和 P-AKT-T308,表达出现了 明显的降低;PI3K、GSK3β 在mAb-EGFR/Au+NIR、Au+NIR和mAb-EGFR/Au、Au处理因素下呈现明显的下降趋势;P-PTEN 在 mAb-EGFR/Au+NIR、mAb-EGFR/Au、EGFR 处理因素下有上升趋势;在DNA损伤通路中,P53各个实验组与对照组相比较有明显上升;ATR、P-CHK1 和 P-CHK2 在 mAb-EGFR/Au+NIR、mAb-EGFR/Au、EGFR 处理因素下逐渐上升;P-PDK1在EGFR和mAb-EGFR/Au处理因素中有上升趋势,但是在mAb-EGFR/Au+NIR组中表达降低。[结论]1、mAb-EGFR功能化修饰的纳米金棒能够进入到人下咽癌FaDu细胞中。2、当纳米金棒的吸光度OD值约为1.3时,浓度为15%-25%的纳米金棒溶液能够有效杀伤下咽癌细胞而对非肿瘤细胞损伤较小。3、体外实验中,对近红外激光对纳米金棒作用的细胞照射时间为6分钟。4、mAb-EGFR功能化修饰纳米金棒近红外激光诱导使人咽部鳞癌FaDu肿瘤细胞发生凋亡。5、mAb-EGFR功能化修饰纳米金棒近红外激光诱导下,阻断了 AKT的磷酸化,从而使PI3K/AKT/mTOR信号通路失活,阻止了细胞DNA的修复,诱导人咽部鳞癌FaDu肿瘤细胞发生凋亡。