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目的:2018年全球肿瘤统计分析结果,肺癌发病率及死亡率均居首位,虽然吸烟被认为是肺癌最主要和已确证的危险因素,但非吸烟患者数量逐年递增,因此除吸烟之外的致癌病因的探索是很有必要的。近年来,HPV与肺癌相关性逐渐的引起研究者重视起来。HPV16 E6/E7蛋白是主要的致癌基因。癌细胞利用Warburg效应消耗更多的葡萄糖,通过有氧糖酵解获得能量,活化的GLUT1是该过程中的主要葡萄糖转运蛋白。我们以前的研究表明,HPV16 E6/E7蛋白上调了肺癌细胞中GLUT1的表达。然而,该过程中E6和E7蛋白是否能促进GLUT1的葡萄糖摄取及其分子机制尚不清楚。机制研究表明,细胞内GLUT1的过表达不是GLUT1活化的关键点。通过刺激增加GLUT1从细胞质向细胞膜的转运,或刺激已经存在于细胞膜上的GLUT1转运蛋白的活性来激活GLUT1。因此GLUT1易位至质膜,并且该过程中涉及的潜在分子机制是当前研究的主要目的。Barnes等人表明,调节GLUT1激活的机制与AMP激活的蛋白激酶（AMPK）活性的刺激有关,有文献报道,NBR2是一种由葡萄糖缺乏诱导的lnc RNA。在葡萄糖饥饿的前提下,NBR2与AMPK的相互作用可促进AMPK激酶的活性。同时有研究者提出了lnc RNA NBR2是通过GLUT1来调节癌细胞对双胍类药物敏感性。基于上述依据,我们提出HPV16E6/E7、NBR2、AMPK、GLUT1在HPV相关的肺癌细胞系中存在调控关系,尤其是阐明HPV16E6/E7是否通过抑制NBR2磷酸化AMPK促进而上调GLUT1的表达水平,并促进了肺癌细胞中GLUT1的质膜转位及葡萄糖摄取的能力。通过探讨肺癌发生发展的作用和可能存在的分子机制,为HPV相关肺癌的诊断与治疗提供新途径。研究方法:1.所有支气管镜检查均由两名经验丰富的支气管镜医师使用标准视频支气管镜、灵活的长活检钳和直刷进行。支气管镜的活检和刷检均取自所有受试者。组织学和细胞学标本分别在不同的实验室进行处理,并由2名不同的病理学家在每天不同的时间分别进行回顾和报告。可疑的恶性区域进行刷检2-3次,涂片采用95%酒精固定,后进行巴氏染色。下一步,从同一刷检部位钳夹活检标本进行组织学检查,处理后进行苏木精-伊红（H&E）染色和/或免疫组织化学染色。TBNA标本用于组织学蜡块和细胞学涂片。根据钳夹活检、TBNA和切除标本的组织学诊断以及刷检和TBNA的细胞学诊断,将诊断结果分别记录到组织学组和细胞学组。2.我们通过转染以及干扰技术双向调控肺癌细胞中的HPV16 E6和E7表达,并应用蛋白免疫印迹（Western blotting）检测GLUT1、AMPK、p-AMPK（Thr-172）的蛋白表达变化,应用实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测GLUT1、AMPK、和NBR2的m RNA表达水平。3.应用转染及干扰技术双向调控肺癌细胞中NBR2的表达,应用Western blotting和Real-time PCR实验分别检测AMPK、p-AMPK（Thr-172）和GLUT1的表达水平。4.采用了干扰技术来调控肺癌细胞中AMPK的表达,并通过Western blotting和Real-time PCR实验检测GLUT1蛋白和m RNA的表达水平。5.采用免疫荧光实验技术和葡萄糖摄取实验技术,通过共聚焦显微镜观察GLUT1的质膜分布情况与葡萄糖摄取情况。6.应用SPSS22.0统计分析软件,处理分析实验数据,以p<0.05表示具有显著性差异。结果:1.我们发现与腺癌细胞易混淆的正常细胞群中纤毛细胞的存在,是一个重要线索。我们总结了四种细胞类型的纤维细胞,包括粘液柱状细胞、纤毛立方细胞、纤毛柱状细胞、及反应性纤毛细胞。细胞学诊断的结果与细胞核增大及细胞排列密切相关。单个细胞核的增大、多阶段乳头的排列和细胞核的普遍增大,这是解释腺癌细胞的主要依据,逃逸细胞则是解释可疑癌细胞及异型增生细胞的主要线索。2.肺癌细胞系的筛选课题组前期研究结果提示,人肺腺癌细胞（A549）和人肺鳞癌细胞（SK）分别是E6和E7高表达的细胞系,而人肺腺癌细胞（H1299）是E6和E7的低表达细胞系,同时在A549、SK及H1299细胞系中均可观察到GLUT1在质膜上的表达,并且均发生了低葡萄糖摄取。因此,我们选择在A549和SK两种细胞系中转染E6和E7小si RNA干扰体,而H1299细胞系转染p EGFP-N1-HPV16 E6和p EGFP-N1-HPV16 E7质粒。其次我们应用Real-time PCR和Western blotting实验检测了人肺腺癌细胞（A549）,人肺鳞癌细胞（SK）和人肺腺癌细胞（H1299）中NBR2、p-AMPK（Thr-172）的表达。选择人支气管上皮细胞（HBE）作为NBR2和p-AMPK（Thr-172）表达水平的对照,高于HBE被认为是高表达,低于HBE被认为是低表达。我们发现NBR2的表达水平在SK较高,但在A549和H1299中较低。p-AMPK（Thr-172）的表达水平在A549、H1299、SK肺癌细胞系中较高。基于此结果,我们选择在A549和H1299细胞系中转染NBR2的模拟物,在SK细胞系中转染NBR2的抑制物;选择在A549、H1299、SK细胞系中转染小si RNA干扰其内源p-AMPK（Thr-172）的表达。3.HPV16 E6/E7下调NBR2和p-AMPK（Thr-172）的表达,但上调GLUT1的表达。我们将p EGFP-N1-E6/E7瞬时转入低表达E6/E7的H1299中,以E6/E7空载体和模拟转染为对照,应用Western blotting和Real-time PCR的方法分别检测E6转染效率及AMPK、p-AMPK（Thr-172）、NBR2、GLUT1的表达。结果表明,过表达E6/E7显著下调了NBR2 m RNA、AMPK m RNA、p-AMPK（Thr-172）蛋白的表达,同时上调了GLUT1蛋白和m RNA的表达,AMPK的蛋白表达显示极少或无变化。4.敲除E6/E7上调NBR2和p-AMPK（Thr-172）的表达,但下调GLUT1的表达。为了进一步验证E6/E7对NBR2,p-AMPK（Thr-172）,AMPK和GLUT1的调控作用,应用E6/E7特异性si RNA瞬时转入高表达E6/E7的A549及SK细胞中,以E6非特异性si RNA和模拟特异性si RNA为对照。并且应用Western blotting和Realtime PCR实验分别检测E6/E7转染效率及AMPK、p-AMPK（Thr-172）、NBR2、GLUT1的表达。结果显示抑制E6/E7表达,显著上调了NBR2 m RNA、AMPK m RNA、p-AMPK（Thr-172）蛋白的表达,同时下调了GLUT1蛋白和m RNA的表达,AMPK的蛋白表达显示极少或无变化。5.NBR2上调p-AMPK（Thr-172）,下调GLUT1的表达。将NBR2模拟物被瞬时转染到低表达的A549和H1299细胞系中,NBR2空载体和模拟转染作为对照。并且应用Western blotting和Real-time PCR实验分别检测其转染效率及AMPK、pAMPK（Thr-172）、GLUT1的表达。结果显示,过表达NBR2显著上调了AMPK m RNA、p-AMPK（Thr-172）蛋白的表达,同时下调了GLUT1蛋白和m RNA的表达,AMPK的蛋白表达显示极少或无变化。6.敲除NBR2下调p-AMPK（Thr-172）,上调GLUT1的表达。选择高表达NBR2的细胞系SK,应用NBR2特异性Si RNA敲除NBR2的表达,以NBR2非特异Si RNA和模拟特异性Si RNA作为对照。应用Western blotting和Real-time PCR实验分别检测其转染效率及AMPK、p-AMPK（Thr-172）、GLUT1的表达。结果表明,抑制NBR2的表达明显下调了AMPK m RNA、p-AMPK（Thr-172）蛋白的表达,同时上调了GLUT1蛋白和m RNA的表达,AMPK的蛋白表达显示极少或无变化。7.敲除AMPK,上调GLUT1的表达。选择高表达p-AMPK（Thr-172）的细胞系（A549、H1299、SK）,应用AMPK特异性si RNA敲除p-AMPK（Thr-172）的表达,非特异性si RNA和模拟特异性si RNA作为对照。应用Western blotting和Realtime PCR实验分别检测AMPK、p-AMPK（Thr-172）、GLUT1的表达。结果表明,抑制p-AMPK（Thr-172）显著上调了GLUT1蛋白和m RNA的表达,AMPK的蛋白表达显示极少或无变化。8.敲除AMPK显著促进了A549细胞GLUT1的质膜易位和葡萄糖摄取。将AMPK特异性si RNA转染至A549细胞中,非特异性si RNA作为对照。Western blotting实验结果显示p-AMPK（Thr-172）蛋白表达降低,同时GLUT1蛋白表达增高。免疫荧光技术在共聚焦显微镜下观察GLUT1在细胞膜表达量明显增多,胞浆中GLUT1表达量明显减少。敲除AMPK后,葡萄糖吸收实验显示葡萄糖摄取增加。结论:1.准确识别良性细胞的纤毛和终板,以及腺癌细胞的核增大、排列方式和逃逸状态,对临床细胞学诊断具有重要意义。2.HPV16中的E6和E7蛋白均可下调NBR2m RNA的表达。3.NBR2促进了AMPK的磷酸化。4.抑制AMPK促进GLUT1的质膜转位及葡萄糖摄取。