神经病理性疼痛（Neuropathic pain,NP）的最新定义是“由躯体感觉系统损害或疾病导致的疼痛”,该定义是2008年由国际疼痛研究协会（IASP）神经病理性疼痛特别兴趣小组（Neu PSIG）确立的。慢性神经病理性疼痛持续时间长,疼痛程度重,常常引发食欲减退、睡眠质量下降、工作能力减低等症状,甚至还会导致抑郁、焦虑等情感障碍的发病率增加,目前临床上缺乏疗效确切的治疗方法,因此对其发病机制及治疗方法的研究是亟待解决的科学问题。目前认为神经病理性疼痛的发病机制主要分为中枢敏化和外周敏化两大方面,其中,中枢敏化起到了关键作用。近来许多研究认为氧化应激在中枢敏化方面发挥了重要的作用。过量的活性氧（Reactive oxygen species,ROS）对细胞器、抗氧化防御系统和其他生物分子功能具有有害影响,会引发包括线粒体功能障碍、胶质细胞活化和炎症反应在内的一系列不良反应,这种不利的环境最终导致了神经病理性疼痛的发生。核因子红系衍生2相关因子2（NF-E2 related factor 2,Nrf2）作为一种重要的转录因子,参与调控多种抗氧化基因的转录过程。因此认为Nrf2信号通路是细胞抵御氧化应激损伤过程中一项重要的防御机制。Nrf2通路参与NP的发病机制已得到越来越多的认可,但Nrf2通路在NP中的介导机制尚不清楚。sirtins（Sirts）是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依赖的组蛋白脱乙酰酶（HDACs）家族,在许多细胞功能学过程中发挥重要作用,包括组蛋白脱乙酰化、蛋白酰化和脱乙酰化等。此外,sirtuins在哺乳动物细胞中具有增强细胞抗氧化水平和抑制细胞中ROS水平的保护性作用。最近的一项体外研究表明sirtuin家族成员Sirt2,通过调节Nrf2的活性影响抗氧化能力。本实验中我们检测了中枢神经系统中Sirt2是否通过Nrf2介导的氧化应激信号通路调节神经病理性疼痛。本课题旨在探究Sirt2能否通过Nrf2介导的氧化应激通路,起到缓解大鼠慢性神经病理性疼痛的作用,从而为寻找神经病理性疼痛的治疗靶点提供新的方向。研究方法:第一部分:神经病理性疼痛过程中大鼠疼痛行为和脊髓中Nrf2及其下游靶点表达的变化。为了观察大鼠疼痛行为随时间变化的过程以及脊髓中Nrf2及其下游靶点NQO1的表达,本部分实验将大鼠分为假手术组（sham）（n=5）和SNI组（n=30）。SNI组行SNI手术,sham组只暴露但不损伤神经。按照分组情况于不同时间点进行SNI手术操作,评估SNI前24小时和SNI后第1、3、7、10和14天,损伤侧后爪对机械刺激的缩爪阈值（PWT）和对热刺激的缩爪潜伏期（PWL）。测量PWT和PWL后处死大鼠。取损伤侧L4-6段脊髓,分别制备全蛋白及核蛋白样品,并进行Western blot实验检测脊髓中Nrf2和NQO1的表达。第二部分:脊髓中Nrf2通路的激活缓解神经病理性疼痛。为探讨Nrf2在脊髓中调节NP的作用,将大鼠分为5个实验组（每组n=4）:假手术组（sham）、未经治疗的SNI组（SNI）、DMSO处理的SNI组（DMSO）、Nrf2激动剂t BHQ 1μM处理的SNI组（t BHQ1μM）和t BHQ 10μM处理的SNI组（t BHQ10μM）。从SNI术后第1天开始,鞘内注射DMSO和t BHQ（溶解于10μL DMSO中）,每天1次,共7天。每天测量疼痛行为学指标缩爪阈值（PWT）和缩爪潜伏期（PWL）,并在方案结束时处死动物,收集脊髓组织进行分子学研究。从损伤侧的L4-6脊髓中分别提取全蛋白及核蛋白,通过Western blot实验检测脊髓全蛋白样品中Nrf2和NQO1以及核蛋白样品中Nrf2的表达;ELISA法检测氧化应激标志物8-羟基-2’-脱氧鸟苷（8-OHd G）水平;利用试剂盒检测抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）的水平。在方案结束时,使用DMSO和t BHQ 10μM处理的另外的SNI大鼠（n=3）进行免疫荧光研究,观察损伤侧脊髓背角中Nrf2的表达量变化和细胞定位情况。第三部分:脊髓中Sirt2上调通过激活Nrf2通路和降低氧化应激水平缓解神经病理性疼痛。首先,为了观察SNI大鼠脊髓中Sirt2表达量随时间变化的过程,将大鼠分为假手术组（sham）（n=5）和SNI组（n=30）。SNI组行SNI手术,sham组只暴露但不损伤神经。在SNI前24小时和SNI后第1、3、7、10和14天,评估损伤侧后爪对机械刺激的缩爪阈值（PWT）和对热刺激的缩爪潜伏期（PWL）。在每个时间点测量PWT和PWL后处死5只SNI大鼠,在最后一个时间点处死sham组大鼠。取损伤侧L4-6段脊髓制备蛋白样品,并进行Western blot实验检测脊髓中Sirt2的表达。之后,为了确定Sirt2在调节Nrf2通路中的作用,将大鼠分为4个实验组（每组n=5）:假手术组（sham）;未经治疗的SNI组（SNI）;用空白对照重组腺病毒处理的SNI组（Ad-control,将1×108PFU空白对照重组腺病毒溶于10μL无菌生理盐水中）和用表达Sirt2的重组腺病毒处理的SNI组（Ad-Sirt2,将1×108PFU重组腺病毒溶于10μL无菌生理盐水中）。在SNI术前24小时鞘内分别注射Ad-control和Ad-Sirt2。每天测量疼痛行为学指标缩爪阈值（PWT）和缩爪潜伏期（PWL）,并在方案结束时处死动物,收集脊髓组织进行分子学研究。用Western blot方法检测脊髓全蛋白样品中Sirt2、Nrf2和NQO1的表达以及核蛋白样品中Nrf2的表达;ELISA法检测氧化应激标志物8-羟基-2’-脱氧鸟苷（8-OHd G）水平;利用试剂盒检测抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）的水平。在方案结束时,用Ad-control和Ad-Sirt2（每组n=3）治疗的另外的SNI大鼠用于免疫荧光研究,验证鞘内注射Ad-Sirt2使脊髓背角中Sirt2过表达的效果。结果:第一部分:神经病理性疼痛过程中大鼠疼痛行为和脊髓中Nrf2及其下游靶点表达的变化。SNI引起显著的机械性痛觉超敏和热痛觉过敏,表现为机械刺激诱发的缩爪阈值（PWT）和热刺激诱发的缩爪潜伏期（PWL）减低。与sham组和D0组相比,PWT与PWL在1天内降低,持续14天。Western blot结果显示,SNI组的脊髓全蛋白裂解物中Nrf2和NQO1的表达在第1天趋于较高,但从SNI术后第7天开始逐渐降低。SNI组脊髓核蛋白裂解物中Nrf2的表达在第1天显著增加,但在第2天开始逐渐减少,从第7天开始,SNI组核部分中的Nrf2表达显著降低。第二部分:脊髓中Nrf2通路的激活缓解神经病理性疼痛。与sham组相比,鞘内注射不同剂量t BHQ后,从SNI术后第4天和第2天起,大鼠的缩爪阈值（PWT）和缩爪潜伏期（PWL）分别升高,表示机械性痛觉超敏和热痛觉过敏程度均减轻。鞘内注射DMSO对SNI大鼠机械性痛觉超敏和热痛觉过敏阈值无影响。两种剂量的t BHQ（1μM和10μM）均能增加脊髓全蛋白裂解物中Nrf2和NQO1的表达,并增加核蛋白裂解物中Nrf2的表达。免疫荧光研究结果表明,鞘内注射t BHQ 10μM的SNI大鼠脊髓中,尤其是细胞核中表现出丰富的Nrf2免疫反应性。与Nrf2和NQO1的表达一致,未经治疗的SNI大鼠的抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）水平显著降低,而8-羟基-2’-脱氧鸟苷（8-OHd G）水平升高。两种剂量的t BHQ鞘内注射均能够逆转SNI诱导的脊髓中SOD和8-OHd G的变化。第三部分:脊髓中Sirt2上调通过激活Nrf2通路和降低氧化应激水平缓解神经病理性疼痛。SNI大鼠脊髓中Sirt2的表达在第1天和第3天没有明显改变,但从术后第7天开始显著降低,直到实验结束（术后14天）都保持在较低水平。与未经治疗的SNI大鼠相比,鞘内注射表达Sirt2的重组腺病毒Ad-Sirt2后SNI大鼠的缩爪阈值（PWT）与缩爪潜伏期（PWL）均升高,表明机械性痛觉超敏和热痛觉过敏程度均减轻。鞘内注射Ad-Sirt2使SNI大鼠脊髓中Sirt2的表达恢复到与sham组相似的水平。重要的是,我们发现鞘内注射Ad-Sirt2的SNI大鼠脊髓全蛋白裂解物中Nrf2和NQO1的表达与sham组大鼠中观察到的正常水平相接近,并且核蛋白裂解物中Nrf2的表达也呈现相同趋势。此外,鞘内注射Ad-Sirt2恢复了SNI诱导的脊髓SOD和8-OHd G的变化,降低了脊髓中氧化应激水平。结论:1、在SNI诱导的慢性神经病理性疼痛大鼠中,Nrf2活性及其下游靶点NQO1在脊髓中的表达均下调。2、激活Nrf2通路使Nrf2的活性以及NQO1的表达上调,并恢复了脊髓中的氧化应激水平,使SNI诱导的神经病理性疼痛大鼠的机械性痛觉超敏和热痛觉过敏行为有所缓解。3、Sirt2在SNI诱导的慢性神经病理性疼痛大鼠脊髓中的表达降低。4、Sirt2过表达阻止了Nrf2活性的减低和NQO1表达的降低,以及脊髓中氧化应激水平的增加,从而改善了机械性痛觉超敏和热痛觉过敏。