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前言:骨质疏松症是一种与增龄相关的内分泌疾病,随着年龄增长发病率不断上升。目前我国是世界上老年人口绝对数最大的国家,骨质疏松症已成为我国面临的重要健康问题。增龄所导致的器官功能减退、肌肉衰退以及性激素下降等均是原发性骨质疏松症的发病因素。甲状腺激素对骨骼发育也至关重要,是骨骼正常成熟的保障。过量甲状腺激素会导致骨吸收和骨形成增加,骨重建周期延长,骨转换加快,最终导致净骨密度降低,以及骨结构破坏。针对抗骨质疏松的治疗主要是抗骨吸收药和促进骨形成药,此外还有一些靶向药物,如RANKL单克隆抗体、组织蛋白酶K抑制剂和骨硬化蛋白单克隆抗体。为了规避甲状腺激素在临床中出现的不良反应,目前许多甲状腺激素类似物被研发问世。四碘甲腺乙酸（tetrac）是一种低效能的甲状腺类似物,由甲状腺素（T4）脱氨衍生而成,同时通过甲状腺激素的非基因组作用,它还可以拮抗甲状腺激素和整合素αvβ3的结合,干扰肿瘤细胞的增殖分化和非恶性病变的血管增殖。而整合素αvβ3在成骨和破骨细胞中均有表达。为此我们设想tetrac是否可以通过整合素αvβ3来影响骨代谢,既可以作用于过量甲状腺激素引起的骨质疏松,又能干预原发性骨质疏松症的进展。本研究拟通过去势手术雌性大鼠模型,评估tetrac对骨质疏松的在体干预效果,观察其对握力、骨密度和骨微结构等的影响;同时通过体外研究探讨tetrac对T3或T4诱导的破骨细胞和成骨细胞分化的影响及相关通路的变化,为甲状腺激素及其类似物在骨代谢中的作用和机制研究提供实验依据。研究方法:对12周龄的SD雌性大鼠行去卵巢手术,模拟人绝经后骨质疏松模型,按数字随机分为假手术组（sham）、去势组（OVX）以及OVX+tetrac组,每组各6只。假手术组仅切除少量脂肪组织,给予生理盐水腹腔注射;去势组,切除大鼠双侧卵巢,给予生理盐水腹腔注射;药物干预组,在去势组基础上腹腔注射tetrac,共干预18周。用大/小鼠抓力仪测定大鼠四肢的抓力,双能X线吸收仪（DEXA）测定活体大鼠的骨密度,微量X射线断层扫描（Micro-CT）测定骨微结构。对大鼠股骨进行HE染色和免疫组化,测定骨组织中骨转换标志物的水平。酶联免疫吸附剂测定（ELISA）血清中PINP、CTX和TRAP,放射免疫法测定血清游离T4、TSH和骨钙素。培养小鼠破骨前体细胞RAW264.7和小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1两种细胞系,RANKL和M-CSF诱导RAW264.7成为成熟破骨细胞,β-甘油磷酸钠和抗坏血酸诱导MC3T3-E1成为成熟的成骨细胞。加入不同浓度T3和T4刺激,再加入不同浓度的tetrac共同作用,CCK-8检测两种细胞系的活性/毒性;流式细胞术检测两种细胞的凋亡情况;TRAP染色光镜下观察tetrac对破骨细胞分化的影响。选定tetrac最佳浓度后,分组:⑴对照组（即单纯诱导组）;⑵tetrac组;⑶T3刺激组;⑷T4刺激组;⑸T3+tetrac干预组;⑹T4+tetrac干预组。实时定量RT-PCR检测破骨细胞分化基因、成骨细胞分化基因和整合素αvβ3基因的表达;Western blot检测破骨细胞分化蛋白、成骨细胞分化蛋白和整合素αvβ3蛋白的表达,对成骨细胞内和培养液分别进行ALP活力测定。在tetrac和T3或T4共刺激成熟破骨细胞的同时,加入整合素αvβ3抑制剂,观察破骨细胞中MEK和ERK磷酸化蛋白的改变情况。结果:1、动物模型:（1）Tetrac干预18周后大鼠的握力、骨盆骨密度和脊柱骨密度均高于卵巢去势组（p<0.05）,而各组大鼠的全身骨密度无差异（p>0.05）;（2）OVX+tetrac组大鼠的骨体积分数（BV/TV）、骨表面密度（BS/TV）、骨小梁数目（Tb.N）、连接密度（Conn.Dn）、惯性极矩（MMI）和回转极半径（Gr.R）高于OVX组（p<0.05）,骨小梁间距（Tb.Sp）、骨小梁模式因子（Tb.Pf）和结构模型指数（SMI）低于OVX组（p<0.05）,而各组大鼠骨表面体积比（BS/BV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和各向异性程度（DA）等指标无明显差异（p>0.05）。骨微结构3D成像显示OVX组大鼠的骨小梁严重破坏,骨小梁之间距离增大,tetrac干预后骨小梁较前致密。2、体外实验:（1）CCK-8检测显示0-60μM浓度的tetrac对细胞活性没有影响。（2）与对照组相比,100μM tetrac刺激后的MC3T3-E1细胞凋亡率明显上升（P<0.05）,而60μM tetrac刺激后凋亡率明显下降（P<0.05）。不同浓度的tetrac加入RAW264.7细胞后,各组的凋亡率与对照组无明显差异（P>0.05）。（3）抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色显示100μM和60μM浓度的tetrac均可削弱RAW264.7细胞分化为成熟破骨细胞（P<0.05）,60μM为后续实验中选定的tetrac浓度。（4）RT-PCR检测显示Tetrac干预后,T3组和T4组的破骨细胞分化相关基因（TRAP mRNA、MMP-9 mRNA和NFATc1 mRNA）表达均下调（p<0.05）,同时tetrac+T3干预组的CK mRNA水平也低于T3刺激组（p=0.024）。Tetrac+T3干预组的整合素αv和β3mRNA水平均高于T3刺激组（p<0.05）。在成熟MC3T3-E1细胞中,tetrac+T3和tetrac+T4刺激下的OC和PINP mRNA水平较T3组和T4组均无改变,T3+tetrac组整合素β3 mRNA的水平低于T3刺激组（p=0.003）,tetrac+T4组整合素αvmRNA的表达较T4刺激组的增加（p=0.013）。（5）Western blot法检测T3+tetrac组的CK蛋白、TRAP蛋白和MMP-9蛋白水平均低于T3组（p<0.05）,整合素αv和β3蛋白质水平均高于T3组（p<0.05）。T4+tetrac组的TRAP蛋白、NFATc1蛋白和MMP-9蛋白水平均低于T4组（p<0.05）,整合素αv和β3蛋白质水平均高于T4组（p<0.05）。（6）Tetrac加入后,T3和T4组的细胞内ALP活性均增高（p<0.05）,但培养基中ALP无变化。与对照组（抗坏血酸+β-甘油磷酸钠）相比,tetrac组细胞内ALP活力也增高。（7）Tetrac+T3组和tetrac+T4组中RANKL刺激的RAW264.7细胞内MEK的磷酸化水平均较对应的T3和T4刺激组降低（p<0.001）。整合素αvβ3抑制剂+tetrac+T3组p MEK水平高于tetrac+T3组（p=0.023）,而加入整合素αvβ3阻断剂后tetrac+T4组的p-MEK水平无改变（p=0.711）。Tetrac+T4组细胞内p ERK水平低于T4组（p<0.001）,tetrac+T3组细胞内p ERK水平与T3组相比无差异（p>0.05）。整合素αvβ3抑制剂+Tetra+T3组p ERK水平高于tetra+T3组（p<0.05）,而加入整合素αvβ3阻断剂后tetrac+T4组p ERK水平升高（p<0.05）。结论:1、Tetrac改善卵巢去势术所致的骨质疏松大鼠的握力、骨密度和骨微结构。2、Tetrac抑制甲状腺激素刺激下的破骨细胞活性,而对甲状腺激素刺激下的成骨细胞活性无明显影响。Tetrac阻止了T3刺激的破骨细胞MEK磷酸化,和T4刺激的破骨细胞ERK磷酸化;整合素αvβ3选择性抑制剂Cyclo-（-RGDfk）逆转了Tetrac+T3组MEK和ERK的磷酸化,仅逆转tetrac+T4组ERK的磷酸化。Tetrac可能是通过整合素αvβ3介导MAPK信号通路来调节成熟破骨细胞的分化。综合显示tetrac主要作用于甲状腺激素诱导的破骨细胞,可能有助于防治骨质疏松症。