红细胞是哺乳动物血液中数目最多的一种细胞,红细胞最主要的功能是运送有氧代谢必需的氧气,它通过其胞内大量的血红蛋白和血红素携带氧气进入机体各组织,并将有氧代谢产生的二氧化碳运出体外,保证机体正常的新陈代谢。无论是红细胞本身还是血红蛋白,如果在正常或应激造血时其数量及质量出现异常均可使机体呈现轻度或重症的贫血。因此,红细胞稳态的维持是生命所必需的。microRNAs（miRNAs）是一类长度约为18-25个核苷酸的非编码RNA。近二十年的研究表明,它们在整个生物进化过程中起着调节基因表达的作用,在大部分哺乳动物组织的形成过程中扮演重要角色。miR-144/451是高度保守的双顺反子基因簇,这个基因簇编码两个非编码小分子RNA,miR-144和miR-45 1。它们受到红系最重要的转录因子GATA-1直接调控,是目前发现的成熟红细胞中表达量相当高的miRNAs。近年来,研究者开发了 miR-144/451基因敲除小鼠模型,该小鼠表现出小细胞溶血性贫血等红系缺陷。进一步研究发现miR-451通过抑制14-3-3ζ和Cab39保护红细胞免受氧化攻击、促进有核红细胞的存活。miR-451还可通过抑制Myc以及Cox10水平维持红细胞的分化成熟。虽然该基因敲除小鼠模型中miR-144和miR-451均沉默表达,但目前绝大部分报道都只阐述miR-451发挥了主要功能而miR-144作用机制尚不明朗。miR-144是否单独在维持红系稳态中发挥功能及其作用机制值得探究,miR-144和miR-451在红细胞生物学中功能的同异以及两者间协同或拮抗的关系也是学界亟待解决的问题。为此,本课题组首创式地构建了 miR-144单敲除（miR-144基因缺失,miR-451正常表达）的小鼠来观察其在正常和应激造血中的红系表型改变。同时以miR-451基因敲除小鼠（miR-451基因缺失,miR-144正常表达）和miR-144/451基因簇双敲除小鼠（miR-144/451 KO）作为对照,以此研究miR-144单独影响红细胞终末分化以及维持红系稳态的作用及机制。此外,我们还探究了中药姜黄素对贫血小鼠以及红系缺陷的干预作用,以期从中西医结合的角度为贫血及红细胞疾病的治疗提供基础理论支撑。本文研究发现,miR-144基因缺失小鼠在稳态造血时表现为轻度的贫血,在应激状态下贫血加重。miR-144基因缺失导致红细胞终末分化成熟出现障碍,其初步机制为miR-144的缺失导致其直接靶基因Eif5a2（真核翻译起始因子5a2）和Eif4g2（真核翻译起始因子4g2）表达上调,同时核糖体生物学通路激活,晚幼红细胞增殖加剧,退出细胞周期这一过程被延迟,脱核无法进行,因此红细胞的成熟受到阻滞。此外miR-451基因敲除小鼠也存在轻度贫血,其myc的失调导致红细胞终末分化障碍。两者的红系缺陷程度皆弱于miR-144/451基因簇双敲除小鼠,因此我们判断miR-144和miR-451各自通过不互相依赖的独立途径协同促进红系终末分化。而在氧化应激状态下,miR-144降低红细胞抗氧化能力,与miR-451的作用相拮抗。对miR-144基因缺失小鼠的红细胞终末分化使用中药姜黄素进行干预,能够一定程度纠正红系分化的延迟,促进红细胞正常分化成熟。本研究主要分4部分:第1章,观察miR-144基因敲除小鼠在稳态及应激造血中的红系表型改变。第2章,研究miR-144基因缺失小鼠的红细胞终末分化是否有障碍,并找到其作用机制。第3章,通过和miR-451基因敲除小鼠以及miR-144/451基因簇双敲除小鼠对比,探究miR-144和miR-451在红细胞中功能的同异,揭示两者协同/拮抗的关系。第4章,探索中药姜黄素对miR-144基因缺失小鼠红系终末分化的干预作用。第1章miR-144基因缺失小鼠在稳态及应激造血中的红系表型研究目的:探究miR-144在稳态及应激红系造血中的功能方法:我们通过小鼠杂交和基因鉴定,得到适龄野生型小鼠（wild type,WT）和miR-144基因敲除小鼠（miR-144 knock out mice,miR-144 KO）。全血细胞分析检测WT和miR-144 KO小鼠的外周血的血常规指标;外周血涂片和吉姆萨染色观察红细胞形态;流式细胞仪检测稳态时外周血,脾脏,骨髓中各阶段红细胞比例,判断红细胞成熟程度;组织病理技术观察脾脏及骨髓形态;5氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）给予小鼠腹腔注射,清除造血系统中处于增殖期的红系前体细胞后,流式检测红细胞分化指标,检查红细胞代偿增生的快慢;苯肼（Phenylhydrazine,PHZ）给予小鼠腹腔注射,构建急性溶血性贫血模型,观察WT与miR-144 KO小鼠红细胞对氧化攻击的耐受情况;取怀孕14.5天、15.5天、16.5天的小鼠胚胎肝,流式检测红细胞分化指标,判断胚胎发育应激时miR-144 KO小鼠胚胎肝红细胞的成熟程度。结果:1.全血细胞分析检测和外周血涂片结果表明,在小鼠稳态造血情况下,miR-144 KO小鼠的红细胞数量（RBC）无明显改变,红细胞分布宽度（RDW）升高,血红蛋白（Hb）,红细胞压积（HCT）降低。外周血红细胞形态数量与WT相比无明显改变。流式检测红细胞成熟度指标,统计后的结果显示,与WT小鼠相比,miR-144KO小鼠外周血红细胞体积减小,网织红细胞比例无明显变化。脾脏各阶段红细胞比例无明显变化,骨髓中有核红细胞比例增多。2.在5-FU诱导的造血前体细胞消耗应激模型中,miR-144 KO小鼠外周血网织红细胞、脾脏和骨髓有核红细胞重新出现的时间均比野生型小鼠延迟1-2天;在PHZ诱导的急性溶血性贫血应激模型中,miR-144 KO小鼠第5-9天成熟红细胞数目反而比野生型小鼠多;在怀孕16.5天的小鼠胚胎肝细胞中,miR-144 KO小鼠相对成熟的晚期红细胞比例明显低于正常小鼠。结论:1.miR-144基因缺失小鼠在机体稳态造血时表现为小细胞性轻度贫血,并存在轻度的代偿造血。2.miR-144基因缺失小鼠在不同的应激状态下红系代偿造血的能力不同。氧化应激状态下,miR-144基因缺失小鼠抗氧化能力增强。造血前体细胞消耗的应激状态下,miR-144基因缺失小鼠代偿造血过程受到阻滞。胚胎应激发育中,miR-144基因缺失小鼠胚胎肝红细胞发育有所延迟。第2章miR-144基因缺失导致红细胞终末分化障碍及其机制研究目的:探究miR-144在红细胞终末分化中的功能及作用机制方法:为进一步研究miR-144基因敲除小鼠红细胞终末分化的情况,我们通过杂合子杂交的方法得到怀孕14.5天的miR-144杂合子小鼠（miR-144 het,heterozygote）。剖开鼠胚后对子代小鼠胚胎进行基因型鉴定,获得WT和miR-144KO的胎肝细胞。磁珠分选胚胎肝细胞,去除lineage阳性细胞,富集红系造血祖细胞。然后在体外用特定的培养基进行红系诱导分化培养。48 h后流式细胞术检测Ter119,CD71,Hoechst等红细胞分化和脱核的指标,瑞氏吉姆萨染色观察红细胞形态变化,从而比较miR-144KO与WT小鼠从原红细胞分化至网织红细胞的快慢程度。收集miR-144 KO与WT分化36h的细胞,进行EdU细胞周期实验,收集miR-144KO与WT分化24h的细胞,并进行 RNA 测序（RNA seq）,找出差异基因并通过 GSEA（gene set enrichment analysis）富集相关通路。qRT-PCR和Western blot检测Eif5a2和Eif4g2表达水平以及经典红系标志物的表达变化。应用流式细胞术进行EdU染色检测细胞周期。双荧光素酶报告实验验证miR-144与靶基因Eif5a2、Eif4g2的直接绑定关系。构建Eif5a2、Eif4g2过表达质粒和小干扰RNA（shRNA）,在野生型小鼠胚胎肝来源的原红细胞中过表达Eif5a2,在miR-144基因缺失小鼠的红系祖细胞中敲低Eif5a2和Eif4g2,诱导红系分化48 h后流式和形态学检测相关指标。结果:1.胚胎肝来源的造血祖细胞定向诱导红系分化48 h后,与WT相比,miR-144敲除小鼠Ter119+CD71+FSClow的细胞比例,即相对成熟的红细胞比例明显减少。Ter119+Hoechst-FSClow的细胞比例,即脱核的红细胞比例明显减少。形态学检查和镜下统计也观察到脱去核的成熟红细胞较少。2.分化至24 h的中幼红细胞测序结果和GSEA（gene set enrichment analysis）分析发现,miR-144基因缺失后,真核细胞翻译和核糖体合成通路激活,通路相关基因Eif5a2和Eif4g2的mRNA和蛋白表达水平均增高,细胞周期蛋白p21表达降低。应用流式细胞术进行EdU染色实验发现,脱核前的晚幼红细胞G2/M期比例增加。3.通过小鼠胚胎肝来源的红系祖细胞红系诱导分化培养,发现在正常红系终末分化中,Eif5a2和Eif4g2表达水平基本呈下降趋势。在WT小鼠的原红细胞中过表达Eif5a2后,分化至相对成熟的红细胞比例明显减少。4.在miR-144基因缺失小鼠的红系祖细胞中敲低Eif5a2,诱导分化后相对成熟的晚期红细胞比例没有明显改变,而敲低Eif4g2后,成熟的晚期红细胞比例和脱核程度有所上升。5.双荧光素酶报告实验中,共转染miR-144质粒和Eif5a2 3’UTR、Eif4g2 3’UTR后,与对照组相比,萤火虫荧光素酶的活性均降低。结论:1.miR-144基因缺失会导致红细胞终末分化出现障碍。2.Eif5a2和Eif4g2是miR-144的直接靶基因,miR-144的缺失导致中晚幼红细胞内Eif5a2/Eif4g2 表达上调。3.Eif5a2/Eif4g2的表达水平下调以及核糖体合成通路的失活是红细胞终末分化所必需的。4.miR-144通过抑制Eif5a2/Eif4g2促进红细胞终末分化,其机制可能为miR-144缺失导致核糖体生成通路激活,而后细胞增殖加剧,晚幼红细胞退出细胞周期发生延迟,脱核和红细胞成熟由此受到阻滞。第3章miR-144和miR-451在红细胞中功能的异同以及两者的协同抗关系目的:比较miR-144和miR-451在红细胞中的功能异同以及探究两者的协同/拮抗关系方法:我们利用野生型小鼠、miR-144基因敲除小鼠、miR-451基因敲除小鼠以及miR-144/451基因簇双敲除小鼠这四种小鼠作为研究对象,通过血常规和流式细胞术检测正常状态下造血组织的红系造血情况,比较稳态造血时这4种小鼠红系表型差异。5-氟尿嘧啶和苯肼给予小鼠腹腔注射,造成不同种类的应激后,通过流式和形态学观察红细胞代偿生成的快慢以及红细胞对应激的耐受程度,并进行统计学比较。磁珠分选脾脏有核红细胞,qRT-PCR和Western blot检测Nrf2和14-3-3ζ水平。磁珠分选4组基因型小鼠的胚胎肝造血祖细胞,定向诱导红系分化培养48 h,流式细胞术检测Ter119,CD71,Hoechst等红细胞分化和脱核的指标,瑞氏吉姆萨染色观察红细胞形态变化,比较miR-144 KO、miR-451 KO与WT小鼠从原红细胞分化至网织红细胞的快慢程度以及彼此间的差异。qRT-PCR和Western blot检测miR-144 KO小鼠红细胞Myc表达水平以及miR-451 KO小鼠红细胞Eif5a2和Eif4g2表达水平。结果:1.稳态造血状态下,以野生型小鼠为对照,miR-144/451基因簇双敲除的小鼠血常规指标最差,外周血、脾脏和骨髓不成熟的红细胞比例最高,miR-451基因敲除小鼠次之,miR-144基因敲除小鼠最轻。2.在5-FU应激模型中,miR-144/451基因簇双敲除的小鼠外周血新生网织红细胞重新出现的时间最慢,miR-451 KO和miR-144 KO小鼠新生的红细胞也有所延迟,但两者之间没有显著性差异。3.在PHZ氧化应激模型中,miR-451 KO和miR-144/451 KO小鼠外周血细胞形态结构被破坏程度大于野生型小鼠,再生的成熟红细胞比例也低于野生型小鼠,而miR-144 KO小鼠外周血成熟红细胞的出现反而快于野生型小鼠,且红细胞形态更加趋于正常。4.在4组小鼠脾脏有核红细胞中检测Nrf2和14-3-3ζ,miR-144基因缺失导致Nrf2蛋白表达上调而14-3-3 ζ表达无明显改变,miR-451基因缺失导致14-3-3 ζ蛋白表达上调而Nrf2无明显改变。5.胚胎肝来源的造血祖细胞定向诱导红系分化48 h后,形态学检查结合流式检测Ter119+CD71+FSClow细胞发现,与WT相比,miR-144基因缺失和miR-451基因缺失的小鼠脱核细胞均减少,成熟的红细胞比例都明显降低,且miR-451成熟红细胞比例更低,其中miR-144/451基因簇双敲除小鼠脱核和成熟程度最低。6.收集分化24 h的有核红细胞进行Western blot检测,发现miR-144基因缺失导致Eif5a2、Eif4g2表达上调而Myc表达无明显改变,miR-451基因缺失导致Myc蛋白表达上调而Eif5a2、Eif4g2无明显改变。结论:1.机体稳态造血时,miR-144基因敲除小鼠和miR-451基因敲除小鼠的贫血程度都轻于miR-144/451基因簇双敲除小鼠,这说明miR-144和miR-451发挥互相协同的作用防止贫血的发生,维持机体红细胞稳态。2.面对氧化应激压力时,miR-451基因缺失后红细胞抗氧能力下降,而miR-144基因缺失后红细胞抗氧化能力反而增强,这说明在面对氧化应激压力时,miR-144和miR-451发挥拮抗作用,其初步机制可能与miR-144缺失后Nrf2的表达上调有关。3.红细胞终末分化中,两种敲除小鼠的红系终末分化障碍都弱于miR-144/451基因簇双敲除小鼠,这说明miR-144和miR-451发挥互相协同的作用促进红系分化。4.红细胞终末分化中,miR-451基因缺失小鼠较miR-144基因缺失小鼠的分化障碍程度更重。其中,miR-144通过抑制Eif5a2/Eif4g2水平保证晚幼红细胞退出细胞周期,促使正常红细胞脱核。miR-451通过抑制Myc的表达促进红细胞分化,两者的分子途径独立且不相互依赖。第4章姜黄素对miR-144基因缺失小鼠红细胞终末分化的干预研宄目的:探究姜黄素（CUR）改善miR-144基因缺失小鼠红细胞终末分化的作用及机制方法:使用5-FU给予miR-144 KO小鼠腹腔注射,同时使用姜黄素连续给药10天,流式检测外周血红细胞分化指标Ter1 19和CD71,比较姜黄素用药前后红细胞代偿生成的速度,并使用全血细胞分析仪记录血常规指标。磁珠分选miR-144 KO胚胎肝细胞,去除lineage阳性细胞,富集红系造血祖细胞。在特定的红系增殖培养中基中进行扩增培养,CCK-8细胞毒性实验检测姜黄素在小鼠胚胎肝来源的原红细胞中的半数抑制率IC50。姜黄素处理细胞72 h后换成分化培养液诱导红系分化。48 h后流式细胞术检测Ter119,CD71,Hoechst等红细胞分化和脱核的指标,瑞氏吉姆萨染色观察红细胞形态变化。姜黄素干预分化36 h后,应用流式细胞术进行细胞周期检测姜黄素对红细胞周期的影响。qRT-PCR和Western blot检测经典红系基因的表达变化和周期相关蛋白。结果:1.使用5-FU后,在miR-144 KO小鼠应激造血的过程中,姜黄素给药组外周血新生网织红细胞出现的时间比对照组早两天,且姜黄素给药组的血常规指标更好。2.形态学检查发现姜黄素处理组的脱核的细胞增多。流式细胞术检测发现,姜黄素处理组相对成熟的红细胞（Ter119+CD71+FSClow,Ter119+Hoechst-FSClow）比例明显上升。3.流式检测细胞周期发现姜黄素处理组红细胞G0/G1期比例增加,细胞周期抑制蛋白p21表达增高,细胞增殖减缓。结论:1.姜黄素给药可以在应激状态下增强miR-144基因缺失小鼠的红系代偿造血。2.姜黄素能够一定程度纠正miR-144基因缺失小鼠的红细胞分化障碍,其初步机制可能与姜黄素上调p21表达水平,抑制晚幼红细胞增殖有关。