目的：皮肤鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC,简称鳞癌)是起源于表皮的一种恶性肿瘤，其发病率逐年上升。对常规治疗效果不佳，外科手术是首选的治疗方法，然而皮肤鳞癌转移后的治疗是期待解决的问题。因此，寻求有效的药物进行治疗具有重要意义。维甲酸类（retinoids）属于维生素A的一类衍生物，包含多种同分异构体：13-顺式维甲酸，全反式维甲酸，9-顺式维甲酸等。以往研究证明维甲酸类化合物在细胞的增生、分化，皮肤炎症过程中发挥重要作用，对肿瘤细胞具有很强的诱导分化﹑抑制增殖的作用。肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）由巨噬细胞产生及释放，同时，B淋巴细胞产生一种与TNF类似的淋巴毒素,其与TNF享有共同受体。为了区分,巨噬细胞产生的毒素称为TNF-α，淋巴细胞产生的毒素称为TNF-β，通过与细胞膜表面的对应受体结合，激活细胞信号转导系统可引起肿瘤细胞的凋亡，TNF-α可使肿瘤局部产生凝血，肿瘤血源阻断引起局部缺血坏死，可抑制肿瘤细胞生长。本研究以人表皮鳞癌细胞株A431为研究对象，探讨阿维A酸TNF-α在不同浓度、不同作用时间上对鳞状细胞癌的作用及形态分化的影响，探讨两药联合应用对人A431细胞表达Caspase-3的影响。方法：1细胞培养：在DMEM培养基中培养A431细胞，置于饱和湿度、37℃、5%CO2的培养箱内做常规传代培养。2用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测2.1TNF-α对A431细胞增殖抑制率的影响设空白对照组﹑阴性对照组和实验组，实验组分为浓度为1U／L、2U／L.、5U/L的TNF-α组分别于加药后培养12h﹑24h﹑48h进行测定。2.2测定阿维A、阿维A联合TNF-α对A431细胞增殖抑制率的影响设空白对照组﹑阴性对照组和实验组，实验组又分为浓度各为10μmol／L阿维A酸组，10μmol／L阿维A酸组与5U/L TNF-α组联合用药组，分别于加药后培养24h﹑48h﹑72h进行测定。3倒置相差显微镜及HE染色法观察经过不同浓度药物及联合药物处理后细胞的分化及形态变化。4应用免疫细胞化学法测定对Caspase-3蛋白表达的影响。5流式细胞仪（FCM）检测不同浓度药物及联合药物处理的A431细胞Caspase-3蛋白表达状况。6运用统计软件SPSS13.0对数据进行统计分析。结果：1MTT比色分析法检测显示1.1TNF-α对人表皮鳞癌细胞A431增殖抑制的影响TNF-α组与阴性对照组相比，TNF-α在1U/L至5U/L浓度范围内对具有明显的增殖抑制作用，呈现明显的剂量和时间效应关系。在12h、24h、48h时间段内，TNF-α随着浓度的增加对A431细胞的抑制也出现加强，且以浓度为5U/L组作用在48h的抑制率为最高，抑制率相比差异（P<0.05）具有统计学意义。1.2将阿维A按不同浓度进行组合，细胞培养48小时后采用MTT比色法检测各组细胞的抑制率，根据试验结果，我们选择了10μmol／L阿维A进行后续试验。阿维A联合TNF-α组：将实验分为3组，阴性对照组﹑10μmol／L阿维A组﹑10μmol／L阿维A联合5U/L TNF-α组。上述各组药物作用细胞48h后，各实验组细胞的抑制率分别是12.35%﹑23.46%、47.56%，可见联合用药组对细胞的抑制率明显高于单独用药组，差别具有统计学意义（P<0.05）2药物对A431细胞形态及分化的影响2.1加入TNF-α细胞变化主要表现在两方面2.1.1细胞贴壁能力的变化：经24h的处理后，实验组贴壁能力下降，部分细胞呈漂浮状态，而对照组细胞贴壁能力无明显变化。随着对处理时间的加长及增加药物的浓度，细胞贴壁能力比之前明显下降。2.1.2细胞大小和形态的变化：处理24h后，实验组仅少部分细胞变小、变圆，而对照组未有明显变化。继续延长处理时间及加大药物的浓度，细胞的分布出现分散，呈显著皱缩，甚至破裂，失去原有折光性，生长缓慢。2.2联合药物后细胞变化主要表现在两方面。2.2.1细胞贴壁能力的变化：处理24h后，实验组贴壁能力明显下降，部分细胞呈漂浮生长状态，而阴性对照组细胞贴壁能力未有明显变化，贴壁良好。2.2.2细胞大小和形态的变化：处理24h后，实验组少数细胞变小、变圆，而阴性对照组细胞形态和大小未有明显变化。随着处理时间的增长，药物浓度的增加，细胞散在分布，呈显著皱缩，甚至破裂，失去原有折光性，生长缓慢。而阴性对照组细胞数目增多贴壁生长，多角形，可见伪足，胞浆饱满，折光性强，相邻细胞生长汇合成片，逐渐形成细胞单层，无细胞脱落。3免疫细胞化学s-p法检测3.1TNF对A431细胞Caspase-3蛋白表达的影响：阴性对照组细胞经过免疫细胞化学染色后Caspase-3蛋白表达较少，其胞浆中有少量深棕色颗粒。经过浓度为1U/L、2U/L、5U/L的TNF-α作用48h后，Caspase-3蛋白的表达就有明显增高，并且随着作用时间的增长，作用药物浓度的增加，Caspase-3蛋白的表达逐渐增高。3.2测定阿维A酸及阿维A联合TNF-α对A431细胞Caspase-3蛋白表达影响：阴性对照组细胞经过免疫细胞化学染色后Caspase-3蛋白表达较少，其胞浆中有少量深棕色颗粒。经过浓度为10μmol／L的阿维A酸，10μmol／L阿维A联合TNF-α作用48h后，10μmol／L阿维A联合TNF-α组Caspase-3蛋白的表达就有明显增高，且较单独10μmol／L阿维A组及TNF-α组增高明显。4流式细胞术检测不同浓度药物作用后，细胞在G1前停滞。而TNF-α可以诱导细胞凋亡。结论：1TNF-α有效地抑制人表皮鳞癌细胞A431的增殖，促使人表皮鳞癌细胞A431的凋亡。2TNF-α促使人表皮鳞癌细胞A431凋亡主要是通过激活Caspase-3途径导致的。3阿维A酸与TNF-α联合应用可以促使人表皮鳞癌细胞A431凋亡，并且比单一阿维A酸或TNF-α效果好。4阿维A酸与TNF-α联合应用促使人表皮鳞癌细胞A431凋亡是通过激活Caspase-3蛋白的表达。