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在体内核酸以多种构象存在,生物分子的构象及功能转化与人类重大疾病如癌症等密切相关。小分子配体可以特异性识别核酸构象,调控核酸构象过渡态出现从而抑制相应的生物学功能。作为纳米器件的首选材料,碳纳米管广泛地应用于基因疗法、药物传递系统等生物医学领域。碳纳米管可以引起DNA的聚集和调控构象过渡态出现等,显现了体内调控DNA结构的巨大潜力。但是目前关于小分子及碳纳米管对核酸的识别调控的很多基本问题并没有得到解答。而这些基本问题的研究将为生理条件下核酸过渡态形成及功能以及碳纳米管作为药物治疗试剂、基因载体及器件等方面应用提供实验依据。
本文通过紫外.可见吸收光谱(UV-Vis)、荧光光谱(FL)、圆二色谱(CD)、高效液相色谱(HPLC)、核磁共振(NMR)、电化学交流伏安(ACV)、紫外热变性和酶切反应等方法研究了药物分子7-氨基放线菌素D对单链DNA的识别调控以及单壁碳纳米管与人类端粒DNA的识别位点、识别机理和结合模式,并基于这种分子识别构建了一种新型E-DNA生物传感器,可在复杂生物体系中选择性检测单壁碳纳米管。主要结果如下:
1、研究了发卡结构茎环尺寸和组成对7AACTD与单链DNA结合的影响:单链寡核苷酸GTTn/GAAnn(n=3,5,7)与7-氨基放线菌素D结合后,可以形成发卡结构复合物;复合物的热稳定性和结合常数均随茎环的尺寸大小先增加后减小;在茎环为5个碱基时,热稳定性和结合常数最大;相同茎环尺寸时,GAAn发卡结构比GTTn发卡结构更稳定,结合亲和性更强。
2、研究了稀土离子Eu3+、Tb3+对7-氨基放线菌素D与GTT3/GAA3结合的影响:单链GTT3和GAA3均可与Eu3+、Tb3+发生能量传递,增强稀土离子的荧光;Eu3+和Tb3+使7-氨基放线菌素D与GTT3的结合亲和性增大11倍,并干扰发卡DNA茎环结构导致稳定性降低。
3、研究了单壁碳纳米管(SWNTs)与人类端粒富含C的DNA序列的相互作用,并探讨了两者的结合位点和结合机理:1H NMR实验证明了SWNTs在近中性以及弱碱性溶液中可以诱导i-motif四股螺旋结构的形成;竞争实验证实SWNTs的加入会使G/C双链趋向不稳定,并向四股螺旋结构转化;S1酶切反应和2-ApC-DNA的荧光淬灭实验表明SWNTs优先结合在i-motif的5’末端的宽沟中,主要与C·C+碱基对和TAA loop作用;SWNTs选择性地稳定并诱导i-motif DNA的机理可能是带负电的SWNTs与带正电的C·C+的相互作用降低了C·C+的pKa,诱导了i-motif结构的形成。
4、研究了SWNTs与富含C的人类端粒DNA的结合对S1酶切动力学的影响:电泳和高效液相色谱表明SWNTs与i-motif DNA结合后S1酶的主要切割位点在5’末端的TAA茎环部分:酶消化反应动力学表明由于SWNTs与i-motif的结合,Sl酶切反应速率明显增加,转换数增大22倍。
5、基于SWNTs-i-motif DNA的相互作用,发展了一种新型、免标记的电化学DNA生物传感器(E-DNA):E-DNA生物传感器可以特异性地识别单壁碳纳米管,检测限可达0.2 ppm; E-DNA生物传感器可以在K562癌细胞裂解液中检测单壁碳纳米管,并且保持良好的灵敏度和特异识别能力。