乙酰胆碱酯酶（acetylcholinestrase，AChE，EC3.1.1.7）是一种重要的丝氨酸水解酶，其经典功能是在神经传导中，将神经递质乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)催化水解为乙酸和胆碱，终止神经冲动，维持正常的神经传导。AChE主要存在于神经元和肌肉接头处，终止神经冲动向肌肉细胞的正常传递。AChE是有机磷(OPs)和氨基甲酸酯(CBs)类杀虫剂的作用靶标。杀虫剂与AChE活性中心位点丝氨酸残基结合，占据酶的催化区域，ACh不能进入和降解。ACh长时间结合在乙酰胆碱受体（AChR）上，持续刺激肌肉细胞，引起昆虫抽搐甚至死亡。此外，AChE还与神经发育、神经细胞分化与迁移、突触的形成有关;AChE参与造血细胞的增殖与分化，参与巨核细胞的形成;AChE还与肿瘤增殖、细胞凋亡有关。　　AChE表达量的增加、膜锚定的增加、特定位点的突变是昆虫抗药性增加的重要原因。家蚕AChE有两种类型（AChE1和AChE2），家蚕AChE1对农药相对敏感。为了研究特定位点的突变(A286S、G312A、L537S)对家蚕AChE1结构、活性以及对农药敏感性的影响，本研究利用原核表达系统表达了突变前后的AChE1基因（wace1和mace1），经过分离和纯化制备了有活性的AChE，研究了活性及抑制动力学的变化;对突变前后的AChE1结构进行了预测，分析了影响AChE1功能的原因;将wace1及mace1转入BmN细胞，研究其在细胞中的表达特征，并进一步确定突变对AChE1活性及抑制动力学的影响;构建了家蚕通用型基因打靶载体(pSK-LoxpFRTA3GFP-IEneo-A3tk)，并利用此载体对BmN细胞ace1进行敲除;将mace1转入到家蚕，构建携带mace1的家蚕。主要研究结果如下:　　1.wace1和mace1的原核表达及功能分析　　为了研究突变对AChE1活性和抑制动力学的影响，本研究利用原核表达系统，对家蚕野生型AChE1（wAChE1）和突变型AChE1(mAChE1)进行了表达;经过复性和纯化得到有活性的AChE1，两者活性差异不显著;用10-6M的毒扁豆碱和10-3mg/mL的辛硫磷孵育后，mAChE1的剩余酶活力分别比wAChE1高4.42％和8.86％。结果表明，突变对AChE1酶的活性无明显影响，但降低了其的对毒扁豆碱和辛硫磷的敏感性。　　2.wAChE1和mAChE1的结构分析　　为了探究突变对AChE1结构的影响，本研究对突变前后AChE1的二级结构及三维结构进行了预测和分析。结果发现，突变改变了AChE1的二级结构和三维结构，影响了催化活性中心部位的空间构象。A286S、G312A突变后的氨基酸残基大于原先的残基，突变后氨基酸侧链伸向活性中心部位，距离仅有2.80(A)和3.68(A)。推测这影响大分子抑制剂与活性中心丝氨酸残基的结合，是mAChE1抑制剂敏感性降低的原因。　　3.wace1和mace1转基因细胞构建　　为了研究wace1与mace1在家蚕细胞中的表达特征及蛋白活性，本研究将wace1与mace1连接到转基因载体pIZT/V5-His，转入BmN细胞，通过筛选和鉴定得到转基因细胞。经过PCR和Western检测，ace1在细胞中正常表达。测定了wace1和mace1转基因细胞中ace1表达量，分别是对照的21.51倍和21.69倍。对转基因细胞AChE活力的检测显示，wace1和mace1转基因细胞AChE活力分别比对照组高10.62％和20.21％。用10-6 M毒扁豆碱和10-3 mg/mL辛硫磷分别与wace1和mace1转基因细胞酶液孵育后，mAChE的剩余酶活力比wAChE分别高7.47％和17.41％。结果表明，转入ace1可以显著提高ace1的表达量，ace1特定位点的突变可以降低AChE对抑制剂的敏感性。　　4.家蚕通用型基因打靶载体的构建及应用　　为了构建适合在家蚕中使用的通用型基因打靶载体，方便实现家蚕的简单基因敲除、条件基因敲除及基因敲入，打靶阳性个体的筛选。本研究以pBluescriptⅡ SK+为骨架，插入了一个Actin3启动子驱动的GFP报告基因和一个IE启动子驱动的正向选择标记基因（新霉素磷酸转移酶基因，neo），并在其两侧各添加一个方向相同的FRT位点，以方便打靶成功后去除正向筛选标记基因，在GFP上游加入多克隆位点(multiple cloning site，MCS) MCSII，在MCSII和下游FRT两侧加入一个方向相同的LoxP以方便实现条件基因敲除，在两个LoxP外侧各加一个多克隆位点，加入一个attP以方便基因的敲入，加入一个Actin3启动子驱动的负选择标记基因（单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，HSV-tk1），构建家蚕通用型基因打靶载体(pSK-LoxpFRTA3GFP-IEneo-A3tk)。　　为了验证基因打靶载体的可行性，本研究利用此载体对家蚕BmN细胞的ace1进行了敲除。克隆ace1的两段序列到家蚕通用型基因打靶载体，分别做为上下游交换臂，转染BmN细胞后，采用G418进行筛选，经筛选后细胞可见绿色荧光，表明GFP和neo正常表达。通过PCR鉴定，外源基因与基因组发生同源重组。结果表明构建的家蚕通用型基因打靶载体可用于家蚕基因打靶。　　5.mace1转基因家蚕的制备　　本研究将pIZT-mace1与脂质体混合，用精子介导法进行转基因，产下的蚕卵正常催青饲养至化蛹，记为G0代。利用体视荧光显微镜对绿色荧光蚕蛹进行筛选，取荧光蚕蛹，正常化蛾并交配产卵，催青饲养，记为G1代，并依次类推。提取G2代蚕蛾基因组，PCR鉴定GFP和转入的mace1，结果检测到GFP和mace1，表明转基因家蚕构建成功。　　本研究首次研究了突变对家蚕AChE1结构和功能的影响，发现三个关键位点的突变，改变了AChE1的结构，降低了其对抑制剂的敏感性;构建了家蚕通用型基因打靶载体，利用此载体对家蚕ace1进行打靶;构建转基因载体，并将mace1转入家蚕。本研究阐明了家蚕AChE1三个位点的突变可以降低对抑制剂的敏感性，为研究AChE突变与抗药性的关系提供新的思路;为家蚕基因敲除和转基因提供素材;也为培育家蚕抗药性新品种提供材料。