目的高效表达嗜热脂肪芽胞杆菌色氨酰-tRNA合成酶(BsTrpRS),获得创新霉素与BsTrpRS的复合物晶体,并利用X-ray进行晶体衍射数据收集和晶体结构程序解析复合物的晶体结构,结合分子动力学模拟从分子水平揭示药物与受体相互作用的机制,为药物的设计与优化提供理论基础。方法1.构建含有BsTrpRS蛋白目的基因的表达载体,利用大肠杆菌表达系统获得TrpRS蛋白的可溶性表达。2.采用亲和层析色谱、离子交换色谱和分子排阻色谱纯化目的蛋白,以期获得纯度在90%以上的BsTrpRS,后通过表面等离子共振法(SPR)和等温滴定量热法(ITC)来检测BsTrpRS的活性。3.选用气相扩散悬滴法,通过优化结晶条件(包括蛋白浓度、沉淀剂浓度、温度和pH等)获得可进行X-ray衍射的高质量晶体,获取衍射数据。4.采用共结晶法获取BsTrpRS与创新霉素复合物的晶体。5.将得到的复合物晶体进行X-ray衍射并收集数据,解析复合物晶体结构,并结合分子动力学模拟和定点突变验证,揭示创新霉素在BsTrpRS靶点的作用机制。结果1.运用分子生物学方法成功构建含BsTrpRS基因的重组质粒,并通过优化得到BsTrpRS蛋白高表达菌株BL21(DE3)。2.运用亲和层析、离子交换色谱和分子排阻色谱等蛋白纯化下游技术,获得高纯度BsTrpRS蛋白。3.通过SPR和ITC技术,验证了BsTrpRS的活性,并确证了创新霉素与BsTrpRS之间具有高亲和力。4.通过晶体筛选,获得了X-ray衍射分辨率为2.06?的创新霉素*BsTrpRS二元复合物晶体和2.16?的创新霉素*ATP*BsTrpRS三元复合物晶体,并解析得到各自的复合物三维结构,结合分子动力学模拟和定点突变验证,从分子水平揭示了创新霉素与BsTrpRS之间的相互作用机制。结论本研究从分子水平阐明了创新霉素与其靶点BsTrpRS相互作用的机制,为创新霉素与BsTrpRS的结合提供了确切的分子结构模型,为后期筛选、设计药效更好的创新霉素药物打下理论基础。图34幅;表13个;参111篇。