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巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)由巨噬细胞、T细胞、脑垂体释放的一种重要的促炎症因子,能通过多种途径促进机体的免疫应答以及炎症反应。MIF的过度表达与脓毒症、类风湿性关节炎、过敏性鼻炎、接触性过敏反应等疾病的发生密切相关,且MIF还能拮抗糖皮质激素的抗炎作用。已有文献证实,脓毒症病人的血清中MIF含量明显升高,MIF基因敲除小鼠对于脓毒症的耐受能力明显增强,抗MIF抗体对于脓毒症模型小鼠具有明显保护作用。同时有研究表明,MIF具有异构酶活性,利用小分子化合物抑制此异构酶活性或者利用基因突变技术使之丧失异构酶活性都能够降低MIF的促炎症作用,并且提高脓毒症小鼠的生存率。但是抗MIF抗体通过何种途径发挥脓毒症保护作用,此作用是否与MIF异构酶活性有关并未见报道。由此,在本室前期研究的基础上,本研究对8株IgG型抗MIF单克隆抗体的生物学活性进行了鉴定;随后构建了盲肠结扎穿孔(Caecal ligation and puncture,CLP)致脓毒症小鼠模型,通过生存率试验筛选得到三株具有明显脓毒症拮抗作用的单克隆抗体,其中抗体F11保护效果最为明显(P<0.01);构建腹腔注射细菌内毒素(lipopolysaccharide,LPS)致脓毒症小鼠模型,进一步验证抗体F11的保护作用,并研究其量效关系;测定了抗体F11对CLP模型小鼠TNF-α、IL-6两种细胞因子的血清浓度的影响,同时对模型小鼠肺、肾组织进行切片染色,观察抗体F11对肺、肾组织的保护作用;通过生物信息学分析得到MIF分子可能的抗原表位,分段克隆表达截短的MIF蛋白以确定8株抗体识别的抗原表位,并分析其是否影响MIF异构酶活性,以期找到抗MIF抗体拮抗脓毒症的作用机制,为进一步研制针对脓毒症的治疗性抗体药物奠定基础。主要研究内容和结果1.抗MIF单克隆抗体的制备与鉴定1)纯化的Trx-MIF蛋白作为免疫原常规免疫BALB/c雌性小鼠,筛选得到8株IgG型单克隆抗体,分别命名为A6、B1、C8、C11、E8、D11、F11和G7。对其进行抗体亚类鉴定,4株抗体(A6、C8、F11、G7)为IgG1亚类,3株抗体(B1、E8、D11)为IgG2b亚类,1株抗体(C11)为IgG3亚类。2)与MIF蛋白、Trx-MIF蛋白及Trx-标签蛋白进行ELISA实验,8株抗体均不与Trx-标签蛋白结合;均与MIF蛋白高度结合;2株抗体(E8、D11)与Trx-MIF结合较弱,其余6株与Trx-MIF高度结合。3)测定8株抗体(A6、B1、C8、C11、E8、D11、F11和G7)的亲和力常数Ka,依次为3.76×108、3.64×108、3.58×108、4.29×108、9.7×108、2.7×108、2.50×1010、2.65×1010。4) Western blotting鉴定8株抗体与MIF重组蛋白的特异性结合,2株抗体(A6、D11)为阳性反应,6株抗体(B1、C8、C11、E8、F11、G7)为强阳性反应。5)免疫细胞化学实验鉴定8株抗体与Raw264.7细胞表达MIF蛋白的特异性结合,3株抗体(A6、C8、D11)为阳性反应,5株抗体(B1、C11、E8、F11、G7)为强阳性反应。2.抗MIF单克隆抗体对脓毒症小鼠的保护作用1)构建CLP致脓毒症小鼠模型,绘制生存曲线图。Sham组小鼠全部存活。与CLP组小鼠存活率相比,无关抗体和5株抗MIF抗体(A6、C8、C11、D11、E8)没有保护效果;2株抗体(B1、G7)具有保护作用,与CLP组相比明显提高小鼠生存率(P<0.05);1株抗体(F11)具有显著保护作用,小鼠存活率显著提高(P<0.01),且72h内小鼠存活率达到100%。2)构建LPS致脓毒症小鼠模型,绘制生存曲线图。与LPS组相比,抗体F11明显提高小鼠生存率(P<0.05)。3)构建CLP小鼠模型,研究抗体F11的剂量-效应关系。CLP模型小鼠分为5组,分别给予生理盐水、2.5mg/Kg、5 mg/Kg、7.5 mg/Kg、10 mg/Kg的F11抗体,观察120h内小鼠存活状况,绘制生存曲线图。抗体浓度为7.5 mg/Kg时显著提高CLP小鼠存活率(P < 0.01),低于此浓度时,抗体对脓毒症小鼠的保护作用呈剂量依赖关系。抗体浓度为10mg/Kg时对脓毒症小鼠保护作用明显下降。4)检测抗体F11对CLP脓毒症小鼠血清TNF-α、IL-6浓度的影响。CLP小鼠血清TNF-α水平于术后6h达到高峰,然后回降。F11组小鼠血清TNF-α水平升高趋势与CLP组一致,但在4h( P < 0.01)、6h( P < 0.05)两个时相点升高程度明显低于CLP组;CLP小鼠血清IL-6水平于术后12h达到高峰,F11组小鼠血清IL-6水平以同样趋势升高,但其升高程度在4h、6h、12h明显低于CLP组(P < 0.01)。5)检测抗体F11对脓毒症小鼠肺组织的保护作用。CLP组小鼠肺组织出现大面积间质水肿、炎细胞浸润及大量肺泡结构崩解;F11组小鼠肺组织损伤明显减轻,间质水肿及炎细胞浸润程度较轻,肺泡结构改变不明显。6)检测抗体F11对脓毒症小鼠肾组织的保护作用。CLP组小鼠肾小管、肾小球损伤,表现为细胞肿胀、空泡形成、中性粒细胞浸润、小管结构排列紊乱、肾小球结构崩解或固缩、球囊壁损伤、肾小球囊腔丧失或增大;F11组小鼠肾损伤明显轻于CLP组,病理改变不明显。3.抗MIF单克隆抗体抗脓毒症作用机制的初步研究1)根据生物信息学分析,分段克隆MIF基因(MIF 64~348, MIF 133~348, MIF 175~348, MIF 1~174),构建pEGX-KG -MIF重组质粒,将测序正确的重组质粒转化BL21细菌,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳,显示条带大小与预期一致。2)应用Western blotting试验鉴定8株抗体识别的表位。8株抗体均与pEGX-KG-MIF1~348及pEGX-KG-MIF1~174表达蛋白结合,均不与pEGX-KG-MIF64~348, pEGX-KG-MIF133~348, pEGX-KG-MIF175~348表达蛋白结合,提示8株抗体的表位识别位点均位于MIF分子N端1~20个氨基酸。3)鉴定8株抗体对MIF异构酶活性的影响。5株抗体(A6、C8、C11、D11、E8)对MIF异构酶活性没有影响,3株抗体(B1、F11、G7)能显著降低MIF异构酶活性(P<0.01),其中F11抗体处理的MIF降低幅度最大。4)鉴定不同浓度F11抗体对MIF异构酶活性的影响。浓度为1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、3μg/ml的F11抗体均显著降低MIF异构酶活性(P<0.01),且当F11抗体浓度为1.5μg/ml时抑制效果比1μg/ml时更明显,而浓度高于1.5μg/ml时抑制效果不再增强。综上所述,本研究首先通过重组的Trx-MIF蛋白免疫BALB/c小鼠制备得到8株IgG型单克隆抗体,对抗体生物学活性进行了鉴定;通过构建小鼠脓毒症模型进行生存率试验,筛选得到三株具有明显脓毒症拮抗作用的单克隆抗体,并对保护作用最为明显的一株抗体进行了进一步研究,测定了其对CLP模型小鼠血清TNF-α、IL-6浓度的影响以及对肺、肾组织的保护作用;为初步分析抗MIF抗体保护脓毒症小鼠的作用机制,通过生物信息学分析得到MIF分子可能的抗原表位并分段克隆表达,Western blotting实验分析8株抗体与各截短MIF蛋白的结合情况,提示8株抗体识别同一区域。而只有具有脓毒症保护作用的3株抗体对MIF异构酶活性有抑制作用,不具有保护作用的5株抗体同样不具有异构酶活性抑制作用,提示抗MIF抗体发挥脓毒症保护作用可能是通过抑制了MIF的异构酶活性蛋白,为进一步研制针对脓毒症的治疗性抗体药物奠定了基础。